• facebook
  • linkedin
  • youtube

Boitsebiso ba ho qala: RNA

Quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) ke mokhoa oa liteko o sebelisoang litekong tsa PCR ho sebelisoa RNA e le ntho ea ho qala.Ka mokhoa ona, kakaretso ea RNA kapa lenqosa RNA (mRNA) e qala ho ngoloa ho DNA e tlatsanang (cDNA) ka reverse transcriptase.Kamora moo, karabelo ea qPCR e ile ea etsoa ho sebelisoa cDNA joalo ka template.RT-qPCR e sebelisitsoe lits'ebetsong tse fapaneng tsa baeloji ea limolek'hule, ho kenyelletsa tlhahlobo ea polelo ea liphatsa tsa lefutso, netefatso ea tšitiso ea RNA, netefatso ea microarray, tlhahlobo ea pathogen, tlhahlobo ea lefutso le lipatlisiso tsa mafu.

Mehato e le 'ngoe le mekhoa e' meli ea RT-qPCR

RT-qPCR e ka finyelloa ka mokhoa o le mong kapa oa mehato e 'meli.Mohato o le mong oa RT-qPCR o kopanya transcript le PCR amplification, e lumellang reverse transcriptase le DNA polymerase ho tlatsa karabelo ka tšupu e tšoanang tlas'a maemo a tšoanang a buffer.Mohato o le mong oa RT-qPCR o hloka feela ts'ebeliso ea li-primers tse ikhethileng ka tatellano.Mehatong e 'meli ea RT-qPCR, reverse transcript le PCR amplification li etsoa ka li-tubes tse peli, ho sebelisoa li-buffer tse fapaneng tse ntlafalitsoeng, maemo a karabelo, le maano a moralo oa pele.

sengoloa1

 

Molemo

Bothata

Mohato o le Mong Mokhoa ona o na le phoso e fokolang ea liteko kaha liketso ka bobeli li etsoa ka tube e le 'ngoe

 

Mehato e fokolang ea lipeipi e fokotsa kotsi ea tšoaetso

 

E loketse bakeng sa ho hōlisa / ho hlahloba ka mokhoa o phahameng, ka potlako ebile e ka hlahisoa hape

Mehato ea mehato e 'meli e ke ke ea ntlafatsoa ka thoko

 

Kaha maemo a karabelo a senyeha ka ho kopanya karabelo ea mehato e 'meli, kutloisiso ha e ntle joalo ka mokhoa oa mehato e' meli.

 

Palo ea liphofu tse fumanoeng ke sampole e le 'ngoe e nyane

Mehato e 'meli Bokhoni ba ho theha lilaebrari tse tsitsitseng tsa cDNA tse ka bolokoang nako e telele le ho sebelisoa liketsong tse ngata.

 

Liphatsa tsa lefutso le liphatsa tsa lefutso li ka holisoa ho tsoa laebraring e le 'ngoe ea cDNA ntle le tlhoko ea lilaebrari tse ngata tsa cDNA.

 

Li-buffers le maemo a karabelo a lumellang ho ntlafatsa ts'ebetso e le 'ngoe

 

Khetho e feto-fetohang ea maemo a trigger

Ho sebelisa li-tubes tse ngata, le mehato e mengata ea lipeipi ho eketsa kotsi ea tšoaetso ea DNA,

le nako e jang.

 

E hloka ho ntlafatsa ho feta mokhoa oa mohato o le mong

Lihlahisoa tse amanang:

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Mohato o le Mong) -SYBR Green I

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Mohato o le Mong)-Taqman

RT Easyᵀᴹ I Master Premix For First-Strand CDNA Synthesis

Nako ea 'Nete PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit

Nako ea 'Nete PCR Easyᵀᴹ-Taqman

Khetho ea kakaretso ea RNA le mRNA

Ha o rala teko ea RT-qPCR, ho bohlokoa ho etsa qeto ea hore na ho sebelisoa RNA eohle kapa mRNA e hloekisitsoeng e le thempleite bakeng sa phetolelo e khutlisetsang morao.Leha mRNA e ka khona ho fana ka kutlo e phahameng hanyane, RNA kaofela e ntse e sebelisoa khafetsa.Lebaka la sena ke hore kakaretso ea RNA e na le molemo oa bohlokoa ho feta oa ho qala ho feta mRNA.Taba ea pele, ts'ebetso e hloka mehato e fokolang ea tlhoekiso, e netefatsang ho hlaphoheloa ha template le ho tloaeleha hantle ha liphetho ho qala linomoro tsa lisele.Ea bobeli, e qoba mohato oa ntlafatso oa mRNA, o ka qobang monyetla oa liphetho tse sothehileng ka lebaka la ho hlaphoheloa ho fapaneng ha li-mRNA tse fapaneng.Ka kakaretso, kaha lits'ebetsong tse ngata palo e lekanyelitsoeng ea mofuta oa lefutso e bohlokoa ho feta kutloisiso e felletseng ea tlhahlobo, kakaretso ea RNA e loketse maemong a mangata.

Reverse transcript primer

Mokhoeng oa mehato e 'meli, mekhoa e meraro e fapaneng e ka sebelisoa ho hlahisa karabelo ea cDNA: li-primers tsa oligo(dT), li-primers tse sa fetoheng, kapa li-primers tse ikhethileng ka tatellano.Ka tloaelo, li-primer tsa oligo(dT) le li-primers tse sa sebetseng li sebelisoa hammoho.Li-primers tsena li amahanngoa le thempleite ea mRNA strand 'me li fana ka reverse transcriptase e nang le qalo ea ho kopanya.

sengoloa2

Khetho ea pele Sebopeho le mosebetsi Molemo Bothata
Oligo(dT) primer (kapa anchored oligo(dT) primer) Annealing e atolositsoeng ho masalla a thymine mohatleng oa poly(A) oa mRNA;anchor oligo(dT) primer e na le G, C, kapa A qetellong ea 3′ (sebaka sa ankora) Motsoako oa cDNA ea bolelele bo felletseng ho tsoa ho poly(A)-tailed mRNA

 

E sebetsa ha lisebelisoa tse fokolang tsa ho qala li fumaneha

 

Sebaka sa ho tiisa se tiisa hore oligo(dT) primer e tlamella 5′ poly(A) mohatla oa mRNA.

E loketse feela ho holisa liphatsa tsa lefutso tse nang le mehatla ea poly(A).

 

Fumana cDNA e qotsitsoeng sebakeng sa priming*2 ka poly(A)

 

E leeme ho tlama ho fihlela pheletsong ea 3*

 

*Monyetla ona oa fokotseha haeba li-primer tsa oligo(dT) li sebelisoa

primer e sa reroang

 

6 ho isa ho li-bases tse 9 ka bolelele, tse ka amang libaka tse ngata nakong ea khatiso ea RNA Anneal ho li-RNA tsohle (tRNA, rRNA, le mRNA)

 

E loketse lingoliloeng tse nang le sebopeho sa bohlokoa sa bobeli, kapa ha ho na le lisebelisoa tse fokolang tse qalang

 

Tlhahiso e phahameng ea cDNA

cDNA e ngotsoe ka morao ho tsoa ho RNA eohle, eo hangata e sa batloeng mme e ka fokotsa lets'oao la sepheo sa mRNA.

 

fumana cDNA e fokotsehileng

li-primers tse ikhethileng ka tatellano Li-primer tsa tloaelo tse shebaneng le tatellano e khethehileng ea mRNA laebrari e khethehileng ea cDNA

 

Ntlafatsa kutloisiso

 

Ho sebelisa li-primer tsa qPCR tse ka morao

E lekanyelitsoe feela ho kopanngoeng ha jini e le 'ngoe ea sepheo

Reverse transcriptase

Reverse transcriptase ke enzyme e sebelisang RNA ho kopanya DNA.Litlhaloso tse ling tsa reverse li na le tšebetso ea RNase 'me li ka theola likhoele tsa RNA ka har'a likhoele tse nyalisitsoeng tsa RNA-DNA kamora ho ngoloa.Haeba e se na tšebetso ea enzymatic ea RNase, RNaseH e ka eketsoa bakeng sa ts'ebetso e phahameng ea qPCR.Li-enzyme tse sebelisoang hangata li kenyelletsa Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase le avian myeloblastoma virus reverse transcriptase.Bakeng sa RT-qPCR, ho loketse ho khetha reverse transcriptase e nang le thermostability e phahameng, e le hore cDNA synthesis e ka etsoa ka mocheso o phahameng, ho netefatsa hore ho ngoloa ka katleho ha RNAs ka sebopeho se phahameng sa bobeli, ha ho ntse ho boloka mosebetsi oa bona o feletseng nakong eohle ea karabelo, ho fella ka chai e phahameng ea cDNA.

Lihlahisoa tse amanang:

E fumaneha habonolo M-MLV Reverse Transcriptase

Mosebetsi oa RNase H oa reverse transcriptase

RNaseH e khona ho nyenyefatsa likhoele tsa RNA ho tsoa ho li-duplexes tsa RNA-DNA, e leng se lumellang hore ho be le motsoako o sebetsang oa DNA e nang le mefuta e 'meli.Leha ho le joalo, ha u sebelisa mRNA e telele e le template, RNA e ka 'na ea senyeha pele ho nako, e leng se etsang hore cDNA e fokotsehe.Ka hona, hangata ho molemo ho fokotsa ts'ebetso ea RNaseH nakong ea cDNA cloning haeba ho batloa lingoloa tse telele.Ka lehlakoreng le leng, li-reverse transcriptases tse nang le tšebetso ea RNase H hangata li molemo bakeng sa lits'ebetso tsa qPCR hobane li ntlafatsa ho qhibiliha ha li-duplexes tsa RNA-DNA nakong ea potoloho ea pele ea PCR.

Moqapi oa pele

Li-primers tsa PCR tse sebelisoang bakeng sa mohato oa qPCR ho RT-qPCR li lokela ho raloa ka nepo hore li pharallane le mateano a exon-exon, moo sehlomathiso sa amplification se ka kenang moeling oa 'nete oa exon-intron.Kaha li-intron-containing genomic DNA tatelano ha li phahamisoe, moqapi ona o fokotsa kotsi ea ho ba le maikutlo a fosahetseng a matlafalitsoeng ho tloha ho silafatsa DNA ea genomic.

Haeba li-primers li ke ke tsa etsetsoa ho arola li-exon kapa meeli ea exon-exon, ho ka 'na ha hlokahala ho tšoara lisampole tsa RNA ka DNase I kapa dsDNase e sa hlokeng RNase ho tlosa tšilafalo ea DNA.

Taolo ea RT-qPCR

Taolo e mpe ea reverse transcript (-RT control) e lokela ho kenyelletsoa litekong tsohle tsa RT-qPCR ho bona tšilafalo ea DNA (joalo ka genomic DNA kapa lihlahisoa tsa PCR ho tsoa liketsong tse fetileng).Taolo ena e na le likarolo tsohle tsa reaction ntle le reverse transcriptase.Kaha ho ngoloa ha reverse ha ho etsahale ka taolo ena, haeba ho holisoa ha PCR ho hlokomeloa, tšoaetso e tsoang ho DNA e ka etsahala haholo.


Nako ea poso: Aug-02-2022