Theknoloji ea tlhahlobo ea limolek'hule e sebelisa mekhoa ea baeloji ea limolek'hule ho bona polelo le sebopeho sa liphatsa tsa lefutso tsa 'mele oa motho le likokoana-hloko tse fapaneng, e le ho fihlela sepheo sa ho bolela esale pele le ho hlahloba mafu.

Lilemong tsa morao tjena, ka ntlafatso le phetisetso ea theknoloji ea tlhahlobo ea limolek'hule, ts'ebeliso ea bongaka ea tlhahlobo ea limolek'hule e se e pharalletse le ho teba, mme 'maraka oa tlhahlobo ea limolek'hule o kene nakong ea nts'etsopele e potlakileng.

Sengoli se akaretsa mahlale a tloaelehileng a tlhahlobo ea limolek'hule 'marakeng,' me e arotsoe likarolo tse tharo: karolo ea pele e hlahisa theknoloji ea PCR, karolo ea bobeli e hlahisa theknoloji ea nucleic acid isothermal amplification, 'me karolo ea bobeli e hlahisa theknoloji ea tatellano.

01

Karolo ea I: PCR Technology

Theknoloji ea PCR

PCR (polymerase chain reaction) ke e 'ngoe ea litheknoloji tsa in vitro DNA amplification, e nang le nalane ea lilemo tse fetang 30.

Theknoloji ea PCR e ile ea qalisoa ka 1983 ke Kary Mullis oa Cetus, USA.Mullis o ile a etsa kopo ea patent ea PCR ka 1985 mme a phatlalatsa pampiri ea pele ea thuto ea PCR ka Saense selemong sona seo.Mullis o ile a hapa Khau ea Nobel ho Chemistry ka 1993.

Melao-motheo ea mantlha ea PCR

PCR e ka holisa likhechana tsa DNA ka makhetlo a fetang milione.Molao-motheo ke hore tlas'a catalysis ea DNA polymerase, DNA ea strand ea motsoali e sebelisoa e le template, 'me ho sebelisoa primer e itseng e le qalo ea ho atolosa.E phetoa ka in vitro ka mehato e kang denaturation, annealing, le extension.Ts'ebetso ea morali oa strand DNA e tlatsetsang ho DNA ea template ea motsoali.

Ts'ebetso e tloaelehileng ea PCR e arotsoe ka mehato e meraro:

1. Denaturation: Sebelisa mocheso o phahameng ho arola likhoele tse peli tsa DNA.Maqhama a haedrojene pakeng tsa likhoele tse peli tsa DNA a robeha mochesong o phahameng (93-98°C).

2. Annealing: Ka mor'a hore DNA e nang le likarolo tse peli e arohane, mocheso o theoleloa e le hore primer e khone ho tlama DNA e nang le ntlha e le 'ngoe.

3. Katoloso: DNA polymerase e qala ho kopanya likhoele tse tlatsanang haufi le likhoele tsa DNA ho tloha ho li-primers tse tlanngoeng ha mocheso o theoha.Ha katoloso e phethiloe, potoloho e phethiloe, 'me palo ea likhechana tsa DNA e imena habeli.

Ho khutlisetsa mehato ena e meraro ka makhetlo a 25-35, palo ea likhechana tsa DNA e tla eketseha ka sekhahla.

Bohlale ba PCR ke hore li-primers tse fapaneng li ka etsoa bakeng sa liphatsa tsa lefutso tse fapaneng, e le hore likaroloana tsa liphatsa tsa lefutso li ka holisoa ka nako e khuts'oane.

Ho fihlela hajoale, PCR e ka aroloa ka mekhahlelo e meraro, e leng PCR e tloaelehileng, PCR ea fluorescent quantitative le PCR ea dijithale.

Moloko oa pele oa PCR e tloaelehileng

Sebelisa sesebelisoa se tloaelehileng sa amplification sa PCR ho holisa mofuta o shebiloeng, ebe u sebelisa agarose gel electrophoresis ho bona sehlahisoa, ho ka etsoa tlhahlobo ea boleng feela.

Litšitiso tse kholo tsa moloko oa pele oa PCR:

- E na le matlafatso e sa tobang le liphetho tse fosahetseng.

-Ho lemoha ho nka nako e telele mme ts'ebetso e boima.

-Ho ka etsoa tlhahlobo ea boleng feela.

PCR ea moloko oa bobeli oa fluorescence quantitative

Fluorescence quantitative PCR (Real-Time PCR), eo hape e tsejoang e le qPCR, e sebelisoa ho lekola ho bokellana ha lihlahisoa tse holisitsoeng ka ho bokella mats'oao a fluorescent ka ho eketsa lisebelisoa tsa fluorescent tse ka bonts'ang tsoelo-pele ea sistimi ea karabelo, le ho ahlola liphetho ka sekhahla sa fluorescence se ka fokotsoang, 'me se thusa ho lekola curve ea fluorescence.

Hobane thekenoloji ea qPCR e etsoa ka mokhoa o koetsoeng, monyetla oa tšilafalo oa fokotseha, 'me lets'oao la fluorescence le ka beoa leihlo bakeng sa ho lemoha bongata, ka hona ke lona le sebelisoang haholo ts'ebetsong ea bongaka mme e fetohile theknoloji e hlahelletseng ho PCR.

Lintho tsa fluorescent tse sebelisoang ho PCR ea nako ea 'nete ea fluorescent li ka aroloa ka: TaqMan fluorescent probes, li-beacon tsa limolek'hule le lidae tsa fluorescent.

1) TaqMan fluorescent probe:

Nakong ea ntlafatso ea PCR, ho eketsoa probe e khethehileng ea fluorescent ha u ntse u eketsa para ea li-primers.Probe ke oligonucleotide, 'me lipheletsong tse peli li ngotsoe ka sehlopha sa motlalehi oa fluorescent le sehlopha sa quencher fluorescent.

Ha probe e tsitsitse, lets'oao la fluorescent le hlahisoang ke sehlopha sa baqolotsi ba litaba le kenngoa ke sehlopha sa quenching;nakong ea ntlafatso ea PCR, ts'ebetso ea 5'-3' ea exonuclease ea enzyme ea Taq e qhekella le ho senya probe, e etsa hore moqolotsi oa litaba oa sehlopha sa fluorescent le quencher Sehlopha sa fluorescent se arohane, e le hore tsamaiso ea fluorescence e ka amohela lets'oao la fluorescence, ke hore, nako le nako ha DNA strand e thehoa, e eketseha, 'me e phahamisa lets'oao le hokahantsoe ka botlalo le sebopeho sa sehlahisoa sa PCR.

2) Lidae tsa fluorescent tsa SYBR:

Sistimi ea karabelo ea PCR, ho eketsoa dae e ngata ea fluorescent ea SYBR.Ka mor'a hore dae ea fluorescent ea SYBR e se ke ea kenngoa ka ho khetheha ho DNA e nang le mefuta e 'meli ea bobeli, e ntša lets'oao la fluorescent.Molek'hule ea dae ea SYBR e sa kenyelletsoeng ketane e ke ke ea ntša letšoao leha e le lefe la fluorescent, ka hona ho netefatsa letšoao la fluorescent Ho eketseha ha lihlahisoa tsa PCR ho lumellana ka ho feletseng le ho eketseha ha lihlahisoa tsa PCR.SYBR e tlama feela ho DNA e nang le likhoele tse peli, kahoo curve e qhibilihang e ka sebelisoa ho fumana hore na karabelo ea PCR e nepahetse.

3) Mabone a molek'hule

Ke "stem-loop" e ngotsoeng ka makhetlo a mabeli ea oligonucleotide e etsang sebopeho sa hairpin sa metheo e ka bang 8 qetellong ea 5 le 3.Tatelano ea li-nucleic acid lipheletsong ka bobeli li kopantsoe ka bobeli, e leng se etsang hore sehlopha sa fluorescent le sehlopha sa quenching se tiee.Haufi, e ke ke ea hlahisa fluorescence.

Ka mor'a hore sehlahisoa sa PCR se hlahisoe, nakong ea ts'ebetso ea annealing, karolo e bohareng ea lebone la molek'hule e kopantsoe le tatellano e itseng ea DNA, 'me gene ea fluorescent e arohanngoa le lefutso la quencher ho hlahisa fluorescence.

Litšitiso tse kholo tsa PCR ea moloko oa bobeli:

Kutloisiso e ntse e haella, 'me ho fumanoa ha mehlala ea likopi tse tlase ha hoa nepahala.

Ho na le tšusumetso ea boleng ba bokamorao, 'me sephetho se ka ba le tšitiso.

PCR ea digital ea moloko oa boraro

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) e lekanya palo ea kopi ea tatellano ea sepheo ka ho lemoha ntlha ea ho qetela, 'me e ka etsa tlhahlobo e nepahetseng ea palo e feletseng ntle le ho sebelisa li-control tsa ka hare le li-curve tse tloaelehileng.

Digital PCR e sebelisa tlhahlobo ea ho qetela 'me ha e itšetlehe ka boleng ba Ct (moeko oa potoloho), kahoo ts'ebetso ea PCR ea digital ha e amehe hakaalo ke bokhoni ba ho hōlisa,' me ho mamellana le PCR reaction inhibitors ho ntlafatsoa, ​​ka ho nepahala ho phahameng le ho ikatisa.

Ka lebaka la litšoaneleho tsa kutloisiso e phahameng le ho nepahala ho phahameng, ha e sitisoe habonolo ke PCR reaction inhibitors, 'me e ka finyella palo e feletseng ea 'nete ntle le lihlahisoa tse tloaelehileng, tse fetohileng hotspot ea lipatlisiso le kopo.

Ho ea ka mefuta e fapaneng ea yuniti ea karabelo, e ka aroloa ka mefuta e meraro: microfluidic, chip le droplet system.