Ct ke mofuta oa bohlokoa ka ho fetisisa oa tlhahiso ea sephetho sa fluorescent quantitative PCR.E sebelisoa ho bala phapang ea polelo ea lefutso kapa nomoro ea kopi ea lefutso.Joale boleng ba Ct ba fluorescence quantification bo nkoa bo utloahala?Mokhoa oa ho etsa bonnete ba hore mofuta o sebetsang oa boleng ba Ct?
Ct Value ke Eng?
Nakong ea ts'ebetso ea matlafatso ea qPCR, palo e tsamaellanang ea li-cycle tsa amplification (Cycle Threshold) ha lets'oao la fluorescence la sehlahisoa se holisitsoeng le fihla moeling o behiloeng oa fluorescence.C e emetse Cycle mme T e emetse Threshold.Ka mantsoe a bonolo feela, boleng ba Ct ke palo ea lipotoloho tse tsamaellanang le ha ntlafatso ea template ea pele e fihlela sehlahisoa se itseng ho qPCR.Seo ho thoeng ke "sehlahisoa se itseng" se tla hlalosoa ka ho eketsehileng hamorao.
Ct value e etsa'ng?
1.Kamano lipakeng tsa amplification ea exponential, chelete ea template le boleng ba Ct
Ka nepo, liphatsa tsa lefutso ho qPCR li bokelloa ka ho holisa exponential kamora palo e itseng ea lipotoloho.Kamano pakeng tsa palo ea li-cycle tsa amplification le palo ea lihlahisoa ke: Amplified product amount = chelete ea template ea pele × (1+En) nomoro ea li-cycle.Leha ho le joalo, karabelo ea qPCR ha e maemong a matle kamehla.Ha palo ea sehlahisoa se matlafalitsoeng se fihla "cheleteng e itseng ea sehlahisoa", palo ea lipotoloho ka nako ena ke boleng ba Ct, 'me e nakong ea ntlafatso ea exponential.Kamano pakeng tsa boleng ba Ct le palo ea thempleite ea ho qala: Ho na le kamano e haufi pakeng tsa boleng ba Ct ba thempleite le logarithm ea nomoro ea kopi e qalang ea thempleite.Ho phahama ha template ea pele ea mahloriso, ho fokotseha ha bohlokoa ba Ct;ho theola khatello ea template ea pele, boleng ba Ct bo boholo.
2.Amplification curve, threshold ea fluorescence le palo e itseng ea sehlahisoa sa PCR
Palo ea sehlahisoa sa qPCR se holisang se hlahisoa ka kotloloho ka sebopeho sa lets'oao la fluorescent, ke hore, lekhalo la amplification.Boemong ba pele ba PCR, ho holisoa ho tlas'a maemo a loketseng, palo ea lipotoloho e nyane, pokello ea lihlahisoa e nyane, 'me boemo ba fluorescence bo ke ke ba khetholloa ka ho hlaka ho tloha mokokotlong oa fluorescence.Ka mor'a moo, fluorescence e eketseha 'me e kena karolong ea exponential.Palo ea sehlahisoa sa PCR e ka bonoa ka nako e itseng ha karabelo ea PCR e le mothating oa exponential, e ka sebelisoang e le "sehlahisoa se itseng", 'me litaba tsa pele tsa template li ka fumanoa ho sena.Ka hona, matla a pontšo ea fluorescence e tsamaellanang le palo e itseng ea sehlahisoa ke moeli oa fluorescence.
Boemong ba morao-rao ba PCR, curve ea amplification ha e sa bonts'a amplification ea exponential, 'me e kena mothating oa mola le sehlabeng.
3.Reproducibility ea litekanyetso tsa Ct
Ha potoloho ea PCR e fihla palo ea potoloho ea boleng ba Ct, e sa tsoa kena nakong ea 'nete ea ho phahamisa exponential.Ka nako ena, phoso e nyenyane ha e e-s'o phahamisoe, kahoo ho ikatisa ha boleng ba Ct ho babatsehang, ke hore, template e tšoanang e matlafatsoa ka linako tse fapaneng kapa ka li-tubes tse fapaneng ka nako e le 'ngoe.Amplification, boleng ba Ct bo fumanoeng bo lula bo le teng.
1.Amplification e sebetsang hantle En
Bokhoni ba ho holisa PCR bo bolela bokhoni boo polymerase e fetolang gene hore e holisoe hore e be amplicon.Matla a ho holisa ha molek'hule e le 'ngoe ea DNA e fetoloa limolek'hule tse peli tsa DNA ke 100%.Matla a ho holisa hangata a hlalosoa joalo ka En.E le ho nolofatsa tlhahlobo ea lihlooho tse latelang, lintlha tse amang katleho ea amplification li hlahisoa ka bokhutšoanyane.
| Lintho tse susumetsang | tlhaloso | Joang ho ahlola? |
| A. PCR inhibitors | 1. Thempleite ea DNA e na le lintho tse thibelang tšebetso ea PCR, tse kang liprotheine kapa lintho tse hloekisang.2. cDNA ka mor'a hore reverse transcription e na le lintho tse ngata tse ngata tsa template ea RNA kapa RT reagent, e ka thibelang ts'ebetso ea PCR e latelang. | 1. Hore na ho na le tšilafalo ho ka ahloloa ka ho lekanya karo-karolelano ea A260 / A280 le A260 / A230 kapa RNA electrophoresis.2. Hore na cDNA e hlapollotsoe ho ea ka karo-karolelano e itseng ka mor'a ho ngoloa ka morao. |
| B. Moralo o sa nepahalang oa primer | Li-primers ha li sebetse hantle | Sheba li-primer bakeng sa li-primer-dimers kapa li-hairpins, tse sa lumellaneng, 'me ka linako tse ling li na le meralo e hlakileng. |
| C. Moralo o sa nepahalang oa lenaneo la karabelo ea PCR | 1. Li-primers ha li khone ho koala hantle2. Ho lokolloa ha DNA polymerase e sa lekaneng 3. Ts'ebetso ea nako e telele ea mocheso o phahameng oa DNA polymerase e fokotsehile | 1. Thempereichara ea annealing e phahame ho feta boleng ba TM ba primer2. Nako ea pre-denaturation e khutšoanyane haholo 3. Nako ea mohato ka mong oa ts'ebetso ea karabelo e telele haholo |
| D. Ho sa lekana ho kopanya li-reagents kapa liphoso tsa liphaephe | Sistimi ea karabelo, mahloriso a lehae a likarolo tsa karabelo ea PCR a phahame haholo kapa ha a lekana, e bakang ho holisoa ho sa bonahaleng ha PCR. | |
| E. Bolelele ba Amplicon | Bolelele ba amplicon bo bolelele haholo, bo feta 300bp, mme bokhoni ba ho holisa bo tlase. | Sheba hore bolelele ba amplicon bo pakeng tsa 80-300bp |
| F. Tšusumetso ea li-reagents tsa qPCR | Khatello ea DNA polymerase ka har'a reagent e tlase kapa khatello ea li-ion ka har'a buffer ha e ntlafatsoe, e leng se etsang hore ts'ebetso ea enzyme ea Taq e se ke ea fihla holimo. | Boikemisetso ba bokhoni ba ho holisa ka mokhoa o tloaelehileng oa curve |
2.Range ea litekanyetso tsa Ct
Litekanyetso tsa Ct li tloha ho 15-35.Haeba boleng ba Ct bo le ka tlase ho 15, ho nkoa hore ho holisoa ho ka har'a nako ea nako ea motheo mme moeli oa fluorescence ha o e-s'o fihleloe.Ka mokhoa o nepahetseng, ho na le kamano ea moeli pakeng tsa boleng ba Ct le logarithm ea nomoro ea pele ea kopi ea template, ke hore, curve e tloaelehileng.Ka sekhahla se tloaelehileng, ha katleho ea amplification e le 100%, tekanyo ea Ct e baloang bakeng sa ho lekanya palo e le 'ngoe ea kopi ea liphatsa tsa lefutso e pota-potile 35. Haeba e kholo ho feta 35, palo ea pele ea kopi ea template e ka tlase ho 1, e ka nkoang e se na moelelo.
Bakeng sa mefuta e fapaneng ea liphatsa tsa lefutso tsa Ct, ka lebaka la phapang ea nomoro ea kopi ea liphatsa tsa lefutso le katleho ea ho holisa palo ea template ea pele, hoa hlokahala ho etsa mokokotlo o tloaelehileng bakeng sa lefutso le ho bala mefuta e mengata ea ho lemoha ea gene.
3. Lintho tse susumetsang tsa bohlokoa ba Ct
Ho tloha kamano pakeng tsa palo ea lipotoloho tsa amplification le palo ea sehlahisoa: palo ea sehlahisoa se matlafalitsoeng = palo ea palo ea potoloho ea template ea pele × (1 + En), ho ka bonoa hore tlas'a maemo a loketseng, palo ea template ea pele le En e tla ba le phello e mpe ho boleng ba Ct e ameha.Phapang ea boleng ba template kapa katleho ea matlafatso e tla etsa hore boleng ba Ct bo be boholo haholo kapa bo be nyane haholo.
4.Ct boleng bo boholo haholo kapa bo nyane haholo
Nako ea poso: Feb-22-2023
