PCR ke thekenoloji e sebelisoang ka ho fetisisa ea nucleic acid amplification 'me e sebelisoa haholo ka lebaka la kutloisiso le ho hlaka ha eona.Leha ho le joalo, PCR e hloka ho phetoa khafetsa ha mocheso 'me ha e khone ho tlosa meeli ea ho itšetleha ka lisebelisoa le lisebelisoa, e fokotsang ts'ebeliso ea eona litekong tsa kliniki.

Ho tloha mathoasong a lilemo tsa bo-1990, lilaboratori tse ngata li qalile ho hlahisa theknoloji e sa khaotseng ea ho phahamisa mocheso e sa hlokeng hore mocheso o fokotsehe.Hona joale ba thehile theknoloji ea amplification ea loop-mediated isothermal amplification, strand replacement isothermal amplification technology, rolling circle isothermal amplification technology, le ho itšetleha ka tatellano ea nucleic acid.Theknoloji ea Isothermal amplification le mahlale a mang. 

Lntlafatso ea isothermal ea oop-mediated

Molao-motheo oa ho hōlisa o thehiloe tabeng ea hore DNA e boemong bo matla ba tekano hoo e ka bang 65°C.Ha primer e 'ngoe le e' ngoe e kopantsoe 'me e fetisetsoa karolong e tlatsetsang ea DNA e nang le mefuta e' meli, strand e 'ngoe e tla ikarola ebe e fetoha khoele e le 'ngoe.

Mocheso ona, DNA e sebelisa li-primers tse 4 tse khethehileng ho itšetleha ka DNA polymerase ea strand-displacement ho etsa hore motsoako oa DNA ea ho falla e itšebe e ntse e tsoela pele.

Qala ka ho tseba libaka tse 6 tse ikhethileng F3, F2, F1, B1, B2, B3 ho mofuta oa lefutso, ebe u rala li-primers tse 4 ho latela libaka tsena tse 6 tse ikhethileng (joalo ka ha ho bonts'itsoe setšoantšong se ka tlase):

The forever inner primer (FIP) e entsoe ka F1c le F2.

The backward inner primer (BIP) e entsoe ka B1c le B2, 'me TTTT e sebelisoa e le spacer bohareng.

Li-primers tsa kantle tsa F3 le B3 ka ho latellana li entsoe ka libaka tsa F3 le B3 ho mofuta oa lefutso.

Lenaneong la karabelo la LAMP, mahloriso a primer e ka hare ke makhetlo a 'maloa ho feta a primer e ka ntle.The primer e ka hare e qala ho kopanngoa le template strand ho kopanya khoele e tlatsanang ho etsa DNA habeli.Ka mor'a moo, primer e ka ntle e kopantsoe le khoele ea template ho etsa DNA e habeli.Tlas'a ketso ea BstDNA polymerase, khoele e tlatsanang e entsoeng ke primer e ka hare e lokolloa.Ka mor'a letoto la liketso, khoele e tlatsanang e qetella e etsa khoele e le 'ngoe ea DNA e nang le sebopeho sa dumbbell.

The dumbbell structure DNA single strand ka boeona e sebelisoa e le thempleite ho tsoela pele ho theha DNA ea transitional stem-loop structure e nang le pheletso e bulehileng.Li-primers tsa ka hare le tsa ka ntle li tataisa DNA ea phetoho ea stem-loop hore e tsoele pele ho kena ka har'a mekhoa ea ho falla le ho atolosa, 'me qetellong e thehe mekhoa e mengata ea li-stem-loop ka bolelele bo fapaneng.DNA motsoako.

Melemo le bofokoli ba loop-mediated isothermal amplification

Melemo ea LAMP:

(1) Ts'ebetso e phahameng ea ho holisa, e ka holisang likopi tse 1-10 tsa mofuta o lebeletsoeng ka har'a 1h, 'me katleho ea matlafatso ke makhetlo a 10-100 a PCR e tloaelehileng.

(2) Nako ea ho arabela e khutšoanyane, e khethehileng e matla, 'me ha ho hlokahale lisebelisoa tse khethehileng.

Mefokolo ea LAMP:

(1) Litlhoko tsa li-primers li phahame haholo.

(2) Sehlahisoa se matlafalitsoeng se ke ke sa sebelisoa bakeng sa cloning le ho latellana, empa se ka sebelisoa feela bakeng sa kahlolo.

(3) Ka lebaka la kutloisiso ea eona e matla, ho bonolo ho etsa li-aerosols, ho baka maikutlo a fosahetseng le ho ama liphello tsa liteko.

Strand displacement amplification

Strand displacement amplification (SDA) ke mokhoa oa in vitro isothermal DNA amplification o thehiloeng ho karabelo ea enzymatic e hlahisitsoeng pele ke setsebi sa Amerika Walker ka 1992.

Sistimi ea mantlha ea SDA e kenyelletsa endonuclease ea thibelo, polymerase ea DNA e nang le ts'ebetso ea ho falla, lipara tse peli tsa li-primers, dNTPs, le calcium le magnesium ion le buffer system.

Molao-motheo oa strand displacement amplification o ipapisitse le tatellano ea tlhokomeliso ea endonuclease e fetotsoeng ka lik'hemik'hale lipheletsong ka bobeli tsa sepheo sa DNA.Endonuclease e bula lekhalo ho DNA ea strand sebakeng sa eona se amohelehang, 'me DNA polymerase e atolosa lekhalo 3' Qetella 'me e nkele sebaka se latelang sa DNA.

Likhoele tse le 'ngoe tsa DNA tse nketsoeng sebaka li ka kopanngoa le li-primers 'me tsa atolosoa ka likhoele tse peli ke DNA polymerase.Ts'ebetso ena e phetoa khafetsa, e le hore tatellano ea sepheo e matlafatsoe hantle.

Melemo le mathata a theknoloji ea strand displacement amplification

Melemo ea SDA:

Matla a ho holisa a phahame, nako ea karabelo e khuts'oane, e ikhethang e matla, 'me ha ho lisebelisoa tse khethehileng tse hlokahalang.

Mefokolo ea SDA:

Lihlahisoa ha li tšoane, 'me lihlahisoa tse ling tse nang le li-stranded le tse peli li lula li hlahisoa ka potoloho ea SDA,' me ho tla etsahala hore ho be le mohatla ha ho fumanoa ke electrophoresis.

Rho phahamisa selikalikoe

Rolling circle amplification (RCA) e sisinngoa ka mokhoa oa ho kopitsa DNA ho likokoana-hloko tsa pathogenic ka ho pota-pota.E bua ka tšebeliso ea DNA e selikalikoe e le 'ngoe e le template ka mocheso o sa khaotseng, le DNA polymerase e khethehileng (e kang Phi29) ) Tlas'a ketso ea ho potoloha selikalikoe sa DNA synthesis ho finyella ho holisoa ha liphatsa tsa lefutso.

RCA e ka aroloa ka amplification ea linear le exponential amplification.Bokhoni ba RCA bo ka fihla ho 10⁵linako, 'me katleho ea exponential RCA e ka fihla ho 10⁹linako.

Phapang e bonolo, joalo ka ha ho bonts'itsoe setšoantšong se ka tlase, amplification ea linear e sebelisa primer e le 'ngoe feela, amplification ea b e na le li-primers tse 2.

Linear RCA e boetse e bitsoa single primer RCA.Primer e tlama DNA e chitja 'me e atolosoa ke ketso ea DNA polymerase.Sehlahisoa ke mohala o le mong oa khoele o nang le palo e kholo ea tatellano e pheta-phetoang makhetlo a likete ho bolelele ba loop e le 'ngoe.

Kaha sehlahisoa sa RCA se nang le linear se lula se hokahane le primer e qalang, ho lokisoa habonolo ha letšoao ke molemo o moholo.

Exponential RCA, e tsejoang hape e le Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA), ka exponential RCA, primer e le 'ngoe e holisa sehlahisoa sa RCA, primer ea bobeli e kopanya le sehlahisoa sa RCA ebe e atoloha,' me phetoho e se e tlameletsoe ho sehlahisoa sa RCA The li-primers tse tlase li atolosa strand, le ho pheta katoloso le ho fetola sehlahisoa sa RCA amplification.

Melemo le bofokoli ba ho phahamisa selikalikoe sa nucleic acid

Melemo ea RCA:

Kutloelo-bohloko e phahameng, boits'oaro bo botle le ts'ebetso e bonolo.

Mefokolo ea RCA:

Mathata a ka morao nakong ea ho lemoha matšoao.Nakong ea karabelo ea RCA, phuputso ea senotlolo e sa potolohang le template ea DNA kapa RNA ea probe e sa tlamisoang li ka hlahisa matšoao a morao-rao. 

Namplification ea tatellano ea ucleicacid

Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) ke theknoloji e ncha e entsoeng motheong oa PCR.Ke amplification e tsoelang pele le ea isothermal nucleic acid e tataisoang ke para ea li-primers tse nang le tatellano ea li-promota tsa T7.Theknoloji e ka holisa thempleite ea RNA ka makhetlo a ka bang 109 ka lihora tse ka bang 2, e leng makhetlo a 1000 ho feta mokhoa o tloaelehileng oa PCR mme ha e hloke lisebelisoa tse khethehileng.

Theknoloji ena e 'nile ea sebelisoa bakeng sa tlhahlobo e potlakileng ea mafu hang ha e hlaha,' me lik'hamphani tse ngata hona joale li sebelisa mokhoa ona ho lisebelisoa tsa ho lemoha tsa RNA.

Le hoja RNA amplification e ka boela ea sebelisa theknoloji ea PCR ea reverse transcription, NASBA e na le melemo ea eona: e ka etsoa tlas'a maemo a mocheso a batlang a sa fetohe, 'me e tsitsitse ebile e nepahetse ho feta theknoloji ea setso ea PCR.

Karabelo e ho likhato tse 41 tsa Celsius 'me e hloka AMV (avian myeloblastosis virus) reverse transcriptase, RNase H, T7 RNA polymerase le para ea li-primers ho qeta.

Ts'ebetso e kenyelletsa haholo-holo:

Primer ea pele e na le tatellano e tlatselletsang ea motšehetsi oa T7.Nakong ea karabelo, primer e ka pele e tlama ho RNA strand mme e hlahisoa ke enzyme ea AMV ho theha DNA-RNA habeli.

RNase H e sila RNA ka har'a lebasetere la mefuta e 'meli 'me e boloka DNA ea mothapo o le mong.

Tlas'a ketso ea "reverse primer" le enzyme ea AMV, DNA e habeli e nang le tatellano ea promotor ea T7 e thehoa.

Tlas'a ketso ea T7 RNA polymerase, mokhoa oa ho ngola o phetheloa 'me palo e kholo ea sepheo sa RNA e hlahisoa.

Melemo ea NASBA:

(1) Primer ea eona e na le tatellano ea motšehetsi oa T7, empa DNA e tsoang linaheng tse ling e nang le mahlakore a mabeli ha e na tatellano ea T7 'me e ke ke ea ntlafatsoa, ​​kahoo theknoloji ena e na le boitsebiso bo phahameng le kutloisiso.

(2) NASBA e kenyelletsa ka ho toba mokhoa oa ho ngola ka morao ho karabelo ea amplification, e khutsufatsa nako ea ho arabela.

Mathata a NASBA:

(1) Likarolo tsa karabelo li rarahane haholoanyane.

(2) Ho hlokahala mefuta e meraro ea li-enzyme ho etsa hore karabelo e be holimo.