PCR (polymerase chain reaction) ke e 'ngoe ea litheknoloji tsa in-vitro DNA amplification, e nang le nalane ea lilemo tse fetang 30.

Theknoloji ea PCR e ile ea qalisoa ke Kary Mullis oa Cetus, USA ka 1983. Mullis o ile a etsa kopo ea tokelo ea molao ea PCR ka 1985 'me a phatlalatsa pampiri ea pele ea thuto ea PCR ka Saense selemong sona seo.Mullis o ile a fuoa Khau ea Nobel ea k'hemistri ka 1993 bakeng sa mosebetsi oa hae.

Melao-motheo ea mantlha ea PCR

PCR e ka holisa likhechana tsa DNA ka makhetlo a fetang milione.Molao-motheo o tlas'a catalysis ea DNA polymerase, ho sebelisa DNA ea motsoali e le template le primer e khethehileng e le qalo ea ho atolosa.E phetoa ka in vitro ka mehato e kang denaturation, annealing, le extension.Ts'ebetso ea morali oa strand DNA e tlatsetsang ho DNA ea template ea motsoali.

Ts'ebetso e tloaelehileng ea PCR e arotsoe ka mehato e meraro:

1.Denaturation: Sebelisa mocheso o phahameng ho arola likhoele tse peli tsa DNA.Maqhama a haedrojene lipakeng tsa likhoele tse peli tsa DNA e robehile mochesong o phahameng (93-98℃).

2.Annealing: Ka mor'a hore DNA e nang le mahlakore a mabeli e arohane, fokotsa mocheso e le hore primer e ka tlama ho DNA e nang le khoele e le 'ngoe.

3.Katoloso: DNA polymerase e qala ho kopanya likhoele tse tlatsanang hammoho le likhoele tsa DNA ho tloha ho li-primers tse tlanngoeng ha mocheso o theoha.Ha katoloso e phethiloe, potoloho e phethiloe, 'me palo ea likhechana tsa DNA e imena habeli

Ho khutlisetsa mehato ena e meraro ka makhetlo a 25-35, palo ea likhechana tsa DNA e tla eketseha ka sekhahla.

Bohlale ba PCR ke hore li-primers tse fapaneng li ka etsoa bakeng sa liphatsa tsa lefutso tse fapaneng, e le hore likarolo tsa liphatsa tsa lefutso li ka holisoa ka nako e khuts'oane.

Ho fihlela hajoale, PCR e ka aroloa ka mekhahlelo e meraro, e leng PCR e tloaelehileng, PCR ea fluorescent quantitative le PCR ea dijithale.

Moloko oa pele oa PCR e tloaelehileng

Sebelisa sesebelisoa se tloaelehileng sa amplification sa PCR ho holisa mofuta o shebiloeng, ebe u sebelisa agarose gel electrophoresis ho bona sehlahisoa, ho ka etsoa tlhahlobo ea boleng feela.

Litšitiso tse kholo tsa moloko oa pele oa PCR:

1.E na le matlafatso e sa tobang le liphetho tse ntle tse fosahetseng.

2.Ho lemoha ho nka nako e telele mme ts'ebetso e boima.

3.Ke teko ea boleng feela e ka etsoang

PCR ea nako ea 'nete ea moloko oa bobeli

Real-Time PCR, eo hape e tsejoang e le qPCR, e sebelisa li-fluorescent probes tse ka bonts'ang tsoelo-pele ea sistimi ea karabelo, le ho lekola ho bokellana ha lihlahisoa tse holisitsoeng ka ho bokella mats'oao a fluorescent, le ho ahlola liphetho ka lekhalo la fluorescence.E ka baloa ka thuso ea boleng ba Cq le curve e tloaelehileng.

Hobane thekenoloji ea qPCR e etsoa ka mokhoa o koetsoeng, monyetla oa tšilafalo oa fokotseha, 'me lets'oao la fluorescence le ka beoa leihlo bakeng sa ho lemoha bongata, ka hona ke lona le sebelisoang haholo ts'ebetsong ea bongaka mme e fetohile theknoloji e hlahelletseng ho PCR.

Lintho tsa fluorescent tse sebelisoang ho PCR ea nako ea 'nete ea fluorescent li ka aroloa ka: TaqMan fluorescent probe, li-beacon tsa limolek'hule le dae ea fluorescent.

1) TaqMan fluorescent probe:

Nakong ea amplification ea PCR, mochine o khethehileng oa fluorescent o eketsoa ha o ntse o eketsa para ea primer.Probe ke oligonucleotide, 'me lipheletsong ka bobeli li ngotsoe ka sehlopha sa motlalehi oa fluorescent le sehlopha sa quencher fluorescent.

Ha probe e tsitsitse, lets'oao la fluorescent le hlahisoang ke sehlopha sa baqolotsi ba litaba le kenngoa ke sehlopha sa quenching;nakong ea ntlafatso ea PCR, ts'ebetso ea 5'-3' ea exonuclease ea enzyme ea Taq e qhekella le ho senya probe, e etsa hore moqolotsi oa litaba oa sehlopha sa fluorescent le quencher Sehlopha sa fluorescent se arohane, e le hore tsamaiso ea fluorescence e ka amohela lets'oao la fluorescence, ke hore, nako le nako ha DNA strand e thehoa, e eketseha, 'me e phahamisa lets'oao le hokahantsoe ka botlalo le sebopeho sa sehlahisoa sa PCR.

2) Dae ea fluorescent ea SYBR:

Sistimi ea karabelo ea PCR, ho eketsoa dae e ngata ea fluorescent ea SYBR.Ka mor'a hore dae ea fluorescent ea SYBR e se ke ea kenngoa ka ho khetheha ho DNA e nang le mefuta e 'meli ea bobeli, e ntša lets'oao la fluorescent.Molek'hule ea dae ea SYBR e sa kenyelletsoeng ketane e ke ke ea ntša letšoao leha e le lefe la fluorescent, ka hona ho netefatsa letšoao la fluorescent Ho eketseha ha lihlahisoa tsa PCR ho lumellana ka ho feletseng le ho eketseha ha lihlahisoa tsa PCR.SYBR e tlama feela ho DNA e nang le likhoele tse peli, kahoo curve e qhibilihang e ka sebelisoa ho fumana hore na karabelo ea PCR e nepahetse.

3) Lebone la molek'hule:

Ke "stem-loop" e ngotsoeng ka makhetlo a mabeli ea oligonucleotide e etsang sebopeho sa hairpin sa metheo e ka bang 8 qetellong ea 5 le 3.Tatelano ea li-nucleic acid lipheletsong ka bobeli li kopantsoe ka bobeli, e leng se etsang hore sehlopha sa fluorescent le sehlopha sa quenching se tiee.Haufi, ha ho na fluorescence e tla hlahisoa.

Ka mor'a hore sehlahisoa sa PCR se hlahisoe, nakong ea ts'ebetso ea annealing, karolo e bohareng ea lebone la molek'hule e kopantsoe le tatellano e itseng ea DNA, 'me gene ea fluorescent e arohanngoa le lefutso la quencher ho hlahisa fluorescence.

Litšitiso tse kholo tsa PCR ea moloko oa bobeli:

Kutloisiso e ntse e haella, 'me ho fumanoa ha mehlala ea likopi tse tlase ha hoa nepahala.

Ho na le tšusumetso ea boleng ba bokamorao, 'me sephetho se ka ba le tšitiso.

Ha ho na le li-inhibitors tsa PCR tsamaisong ea karabelo, liphetho tsa tlhahlobo li ka ba le tšitiso.

PCR ea digital ea moloko oa boraro

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) e lekanya palo ea kopi ea tatellano ea sepheo ka ho lemoha ntlha ea ho qetela, 'me e ka etsa tlhahlobo e nepahetseng ea palo e feletseng ntle le ho sebelisa li-control tsa ka hare le li-curve tse tloaelehileng.

Digital PCR e sebelisa tlhahlobo ea ho qetela 'me ha e itšetlehe ka boleng ba Ct (moeko oa potoloho), kahoo ts'ebetso ea PCR ea digital ha e amehe hakaalo ke bokhoni ba ho matlafatsa,' me ho mamellana le PCR reaction inhibitors ho ntlafatsoa, ​​ka ho nepahala ho phahameng le ho ikatisa.

Ka lebaka la litšoaneleho tsa kutloisiso e phahameng le ho nepahala ho phahameng, ha e sitisoe habonolo ke PCR reaction inhibitors, 'me e ka finyella palo e feletseng ea 'nete ntle le lihlahisoa tse tloaelehileng, tse fetohileng hotspot ea lipatlisiso le kopo.

Ho ea ka mefuta e fapaneng ea yuniti ea karabelo, e ka aroloa ka mefuta e meraro ea mantlha: microfluidic, chip le droplet system.

1) Microfluidic digital PCR, mdPCR:

Ho ipapisitsoe le theknoloji ea microfluidic, template ea DNA e arotsoe.Theknoloji ea microfluidic e ka lemoha mohlala oa nano-upgrade kapa moloko oa marotholi a manyane, empa marotholi a hloka mokhoa o khethehileng oa adsorption ebe o kopantsoe le mokhoa oa ho arabela oa PCR.mdPCR e se e amohetsoe butle-butle ke mekhoa e meng e nkeloang sebaka.

2) PCR ea dijithale e thehiloeng ho Droplet, ddPCR:

Sebelisa theknoloji ea ho hlahisa marotholi a metsi ka har'a oli ho sebetsa sampole hore e be marotholi, 'me u arole sistimi ea karabelo e nang le limolek'hule tsa nucleic acid ka marotholi a likete a nanoscale, ao e 'ngoe le e' ngoe ea tsona e senang molek'hule ea sepheo sa "nucleic acid" e lokelang ho bonoa, kapa E na le molek'hule o le mong ho isa ho tse 'maloa tse reretsoeng ho lekoa.

3) PCR ea dijithale e thehiloeng ho Chip, cdPCR:

Sebelisa theknoloji e kopaneng ea tsela ea mokelikeli ho ngola li-microtubes le li-microcavities tse ngata ho li-wafers tsa silicon kapa khalase ea quartz, le ho laola phallo ea tharollo ka li-valve tse fapaneng tsa taolo, 'me u arole mokelikeli oa sampole ka li-nanometers tsa boholo bo lekanang lilibeng tsa karabelo bakeng sa digital PCR Reaction ho fihlela palo e felletseng.

Litšitiso tse kholo tsa PCR ea moloko oa boraro:

Lisebelisoa le li-reagents li theko e boima.

Litlhoko tsa boleng ba template li holimo.Haeba palo ea template e feta palo ea microsystem, ho ke ke ha khoneha ho lekanya, 'me haeba e le nyenyane haholo, ho nepahala ha quantification ho tla fokotseha.

Maemo a fosahetseng a ka boela a hlahisoa ha ho na le amplification e sa tobang.