Tsebo ea ho lemoha
Maemong a mangata, sepheo sa moralo oa primer ke ho ntlafatsa boleng ba PCR.Sena se khethoa ke tšusumetso e batlang e sa lebelloa ea mefuta e mengata.Phapang e 'ngoe ea bohlokoa ke tatellano e qetellong ea 3' ea primer.
Habohlokoa, litlhahlobo tsa PCR tse etselitsoeng ho hlaka li na le monyetla oa ho boloka ts'ebetso e phahameng ho feta mefuta e mengata e matla, hobane tlhahlobo ha e hlahise lihlahisoa tse sa tobang ka ho khetheha, ka hona e qothisana lehlokoa le li-reagents tsa PCR kapa e thibela karabelo ea mantlha ea amplification.
Ha e le hantle, maemong a mang, ho khetheha ha ho bohlokoa ka ho fetisisa, ka mohlala, ha sepheo e le ho lekanya likokoana-hloko tse amanang haufi-ufi empa tse fapaneng, ho hlokahala moralo o khethehileng, ho ntlafatsa le ho netefatsa litekanyetso.
The melting curve ke mokhoa o tloaelehileng oa ho hlahloba ho khetheha ha li-amplicon, bonyane ho latela hore na ho holisa sepheo se le seng.Leha ho le joalo, ho tlameha ho totobatsoa hore likhahla tse qhibilihisang li ka khelosa hobane, ka mohlala, li ka angoa ke liphello tse kopantsoeng tsa li-primers tse nyenyane le likhahla tse tlaase tsa template.
P5 |Mokokotlo oa ho qhibiliha o bonts'a liphetoho tsa Tm tse fumanoeng ho tsoa ho tse peli tse fumanoeng tsa palo e fapaneng ea li-DNA tse peli tse shebiloeng.
A. Libakeng tse holimo (ad)), ha ho na primer dimer e hlakileng ka mor'a hore tekanyo ea qPCR e phethoe.Ha sebopeho sa template se fokotseha ho fihlela ho likopi tse 50 (e), sehlahisoa se sa ikhethang se qala ho hlaha 'me se fetoha sehlahisoa feela maemong a tlase haholo (f).
B. Teko e ile ea tlaleha li-Tms tse tšoanang maemong ohle a sepheo, 'me ho ne ho se na primer dimer e hlakileng le maemong a tlase haholo (likopi tse 5).Ha u sebelisa mekhoa ena e 'meli ea ho lemoha, ha ho lihlahisoa tsa amplification tse fumanoeng ho li-NTC.
P5 e bonts'a li-curve tsa ho qhibiliha tse fumanoeng ka lisampole moo template e leng teng maemong a fapaneng.P 5a e bontša hore maemong a mabeli a tlaase ka ho fetisisa, Tms ea lihlahisoa tse sa tloaelehang tsa amplification tse hlahisoang li tlaase ho feta tsa li-amplicon tse khethehileng.
Ho hlakile hore mokhoa ona oa ho lemoha o ke ke oa sebelisoa ka mokhoa o ts'epahalang ho fumana liphofu tse teng maemong a tlase.
Ho khahlisang, li-NTC, ke hore, lisampole tse se nang DNA ho hang, ha lia ka tsa rekota lihlahisoa tsa amplification (tse sa tobang), tse bontšang hore DNA ea genomic e ka kenya letsoho ho holisoe ka mokhoa o sa tobang / polymerization.
Ka linako tse ling li-primers tse joalo tsa morao-rao le matlafatso e sa khetheheng li ke ke tsa lokisoa, empa hangata hoa khoneha ho rala mokhoa oa ho lemoha o se nang matlafatso e sa tobang ho kholiso efe kapa efe ea thempleite le NTC (P 5b).
Mona, esita le ho rekota ho holisoa ha mahloriso a sepheo ka Cq ea 35 ho tla hlahisa lekhalo le itseng la ho qhibiliha.Ka mokhoa o ts'oanang, li-NTC ha lia ka tsa bontša matšoao a ho holisa ka mokhoa o sa tobang.Ka nako e 'ngoe, mokhoa oa ho lemoha o ka its'etleha ka joala ba 'm'a, 'me ho fumanoa feela ho holisoa ho sa ikemelang ka mefuta e meng ea li-buffer, e ka amanang le likhakanyo tse fapaneng tsa Mg2+.
Botsitso ba ho lemoha
Ntlafatso ea Ta ke mohato oa bohlokoa molemong oa netefatso le ts'ebetso ea ntlafatso ea qPCR.E fana ka pontšo e tobileng ea ho tiea ha primer e behiloeng ka ho bontša mocheso (kapa mocheso oa mocheso) o hlahisang Cq e tlaase ka ho fetisisa ntle le ho matlafatsa NTC.
Phapang ka makhetlo a mabeli ho isa ho a mane ka kutloisiso e ka 'na ea se ke ea e-ba ea bohlokoa ho batho ba nang le polelo e phahameng ea mRNA, empa bakeng sa liteko tsa ho hlahloba, ho ka bolela phapang pakeng tsa liphello tse ntle le tse fosahetseng.
Thepa ea Ta ea li-primers tsa qPCR e ka fapana haholo.Liteko tse ling ha li matla haholo, 'me haeba li sa etsoe tlas'a boleng bo nepahetseng ba Ta ba li-primers, li tla oa kapele.
Sena ke sa bohlokoa hobane mofuta ona oa ho lemoha hangata o na le mathata lefatšeng la sebele, 'me ho hloeka ha sampuli, ho kopana ha DNA, kapa boteng ba DNA e' ngoe e ka 'na ea se ke ea e-ba molemo.
Ho phaella moo, palo ea kopi e lebisitsoeng e ka 'na ea fapana ka mefuta e mengata,' me li-reagents, lisebelisoa tsa polasetiki kapa lisebelisoa li ka 'na tsa fapana le tse sebelisoang ha ho etsoa tlhahlobo.
P6 | Thempereichara ea mocheso e bonts'a matla a fapaneng a ho lemoha ha PCR.
A. Sebelisa Bioline's Sensifast SYBR mastermix (nomoro ea lethathamo la libuka BIO-98050) ho etsa PCR ho cDNA e lokisitsoeng ho tsoa bokong ba motho ba RNA.
B. Sebelisa sesebelisoa sa Bio-Rad's CFX qPCR ho hatisa 'mapa oa ho hōlisa le ho qhibiliha ha apalene (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Kerafo ea ho phahamisa le ho qhibiliha ha ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Kerafo ea ntlafatso le mothinya oa ho qhibiliha oa GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs e tlalehiloeng ka lithempereichara tse fapaneng tsa annealing, tse bontšang phapang ho Cq e tlalehiloeng tlas'a mocheso oa 7C.
P 6 e bonts'a sephetho se tloaelehileng sa tlhahlobo e sa rateheng, moo qPCR e ileng ea etsoa ho sebelisoa gradient Tas pakeng tsa 59C le 67C (P 6a), ho sebelisa li-primers bakeng sa liphatsa tsa lefutso tse tharo tse khethehileng tsa boko.
Ho ka bonoa ho graph ea amplification hore li-primer tsa Opalin ha li hole hantle hobane mofuta oa bona o nepahetseng oa Ta o moqotetsane haholo (Setšoantšo sa 6b), ke hore, li-Cq li hasane ka bophara, e leng se etsang hore Cqs e bapisoe haholo le Cqs ea bona e tlase.
Mokhoa ona oa ho lemoha ha oa tsitsa 'me o ka lebisa ho matlafatso e sa lekaneng.Ka hona, li-primers tsena li lokela ho fetoloa bocha.Ho phaella moo, tlhahlobo ea melting curve (inset) e bontša hore mokhoa o khethehileng oa mokhoa ona oa ho lemoha o ka 'na oa boela oa e-ba bothata, hobane sekhahla sa ho qhibiliha sa Ta ka 'ngoe se fapane.
Mokhoa oa ho lemoha oa ACSBG1 o bontšitsoeng ho P 6c o matla ho feta mokhoa oa ho lemoha oa Opalin ka holimo, empa o ntse o le hōle le ho loka, 'me ho ka etsahala hore o ka ntlafatsoa.
Leha ho le joalo, re hatisa hore ha ho na kamano e hlokahalang pakeng tsa ho tiea le ho khetheha, hobane lekhalo la ho qhibiliha le hlahisoang ke mokhoa ona oa ho lemoha le bontša boleng bo tšoanang ba tlhōrō ho Tas eohle (inset).
Ka lehlakoreng le leng, teko ea matla e mamella haholo, e hlahisa li-Cq tse tšoanang ka mefuta e mengata ea Tas, joalo ka tekong ea GFAP e bontšitsoeng ho P 6d.
Phapang ea Cqs e fumanoang ka tekanyo e tšoanang ea likhato tse 8 tsa Celsius e ka tlase ho 1, 'me lekhalo la ho qhibiliha (inset) le tiisa litšobotsi tsa ho lemoha mocheso ona oa mocheso.Ke habohlokoa ho hlokomela hore Tas e baloang le mefuta ea sebele ea Ta e ka 'na ea fapana haholo.
Ho na le litataiso tse ngata tse etselitsoeng ho thusa bafuputsi ho etsa li-primers tse sebetsang hantle, tseo boholo ba tsona li thehiloeng melaong ea nako e telele e thehiloeng 'me ho lebisitsoe tlhokomelo e ngata ho 3′ ea li-primers.Hangata ho khothaletsoa ho kenyelletsa G kapa C qetellong ea 3' le metheo e 'meli ea G kapa C (GC clamp), empa eseng ho feta tse peli ho tse 5 tsa ho qetela.
Ha e le hantle, melao ena e ka tataisa bafuputsi, empa ha e hlile ha e nepahale tlas'a maemo ohle.
P7 |The 3′end of the primer e na le phello e fokolang ho tse khethehileng kapa katleho.
A. Boemo ba li-primers bakeng sa lefutso la HIF-1α (NM_181054.2) ea motho.
B. Sebelisa Agilent Brilliant III SYBR tai ea 'mè e tala (Cat. No. 600882) ho matlafatsa lintho tse tšeletseng tsa teko.
C. Amplification graph le melting curve e tlalehiloeng ke Bio-Rad's CFX qPCR sesebelisoa le 3′end primers.Li-NTC li hlahisoa ka bofubelu.
D. Cqs rekoto ea ntho ka 'ngoe ea tlhahlobo
Mohlala, sephetho ho P 7 se hanana le molao oa 3′end.Meralo eohle e fana ka liphetho tse ts'oanang, 'me ho na le metsoako e 'meli feela ea li-primer e lebisang ho holisoe ka mokhoa o sa tobang ho NTC.
Leha ho le joalo, re ke ke ra tšehetsa phello ea sekotwana sa GC, hobane tabeng ena, ho sebelisa A kapa T e le boholo ba metheo ea 30 ha ho fokotse ho khetheha.
Teko ea C, moo F primer e qetellang ho GGCC, e rekotile Cqs ho NTCs, e bontšang hore motho a ka batla ho qoba tatellano ena qetellong ea 30.Re totobatsa hore mokhoa o le mong feela oa ho tseba hore na tatellano e ntle ea 3′ ea li-primer pair ke ho lekola li-primers tse ling ka liteko.
Matla a ho holisa
Habohlokoa, le hoja ho sibolloa ha PCR ka mokhoa o sa tobang ho ka se hlake, bokhoni ba ho holisa bo ka fetoloa le ho holisoa ka mekhoa e mengata e fapaneng ka ho fetola enzyme, joala ba bo-mme, li-additives le maemo a libaesekele.
Ho lekola bokhoni ba ho lemoha ha PCR, ho molemo ho sebelisa serial dilution ea 10 kapa 5 makhetlo a target nucleic acid, ke hore, "mokhoa o tloaelehileng oa curve".
Haeba li-amplicon tsa PCR kapa lipehelo tsa DNA tsa maiketsetso li sebelisoa ho hlahisa lekhalo le tloaelehileng, ho hlapolloa ha liphofu tsa sepheo sena ho lokela ho kopanngoa le palo e sa fetoheng ea DNA (joalo ka genomic DNA).
P8 |Dilution curve ho lekola katleho ea PCR.
A. Sebelisa li-primers bakeng sa HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA le R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC le Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (nomoro ea lethathamo la 600882) bakeng sa PCR le maemo a ho qhibiliha a curve.
B. 100 ng RNA e ne e fetoleloa ka morao, e hlapolotsoe ka makhetlo a 2, 'me lisampole tsa cDNA tse hlapolotsoeng li ile tsa hlapolloa ka makhetlo a 5 ho isa ho 1 ng ea genomic DNA ea motho.Mokokotlo o qhibilihang o bonts'oa ka har'a sets'oants'o.
C. Karabelo ea RT, dilution, le dilution ea serial li ile tsa phetoa bakeng sa sampole ea bobeli ea cDNA, 'me liphetho li ne li tšoana.
P 8 e bonts'a li-curve tse peli tse tloaelehileng, ho sebelisa mokhoa o ts'oanang oa ho lemoha ho lisampole tse peli tse fapaneng tsa cDNA, sephetho ke ts'ebetso e ts'oanang, e ka bang 100%, 'me boleng ba R2 bo boetse bo tšoana, ke hore, tekanyo ea ho lekana pakeng tsa data ea liteko le mohala oa ho khutlela morao kapa data Degree of linearity.
Li-curve tse peli tse tloaelehileng lia bapisoa, empa ha li tšoane hantle.Haeba sepheo e le ho lekanya sepheo ka nepo, ho tlameha ho hlokomeloe hore ha hoa amoheleha ho fana ka palo ea palo ea kopi ntle le ho hlalosa ho hloka botsitso.
P9 |Ho se tiisehe ha tekanyo ho amahanngoang le quantification ho sebelisoa curve e tloaelehileng.
A. Sebelisa li-primers tsa GAPDH (NM_002046) ho etsa PCR le maemo a ho qhibiliha ha curve.F: ACAGTTGCCATGTAGACC le R: TAACTGGTTGAGCACAGG le Bioline's Sensifast SYBR mastermix (nomoro ea lethathamo la libuka BIO-98050).
B. Chate ea Amplification, curve e qhibilihang le mothinya o tloaelehileng o rekotiloeng ka sesebelisoa sa Bio-Rad's CFX qPCR.
C. Standard curve graph le 95% confidence interval (CI).
D. Nomoro ea kopi le nako ea kholiseho ea 95% ea litekanyetso tse tharo tsa Cq tse nkiloeng ho curve ea dilution.
P 9 e bonts'a hore bakeng sa tlhahlobo e ntlafalitsoeng, phapang ea tlhaho ea mothinya o le mong o tloaelehileng e batla e le makhetlo a 2 (95% nako ea ho itšepa, bonyane ho isa ho boholo), e ka bang phapang e nyane haholo e ka lebelloang.
Sehlahisoa se amanang:
Nako ea poso: Sep-30-2021
