Joaloka e ncha ka laboratoring, ha se mosebetsi o motle ho hlahloba limela tse ntle ho tsoa ho sehlopha sa limela tse nang le sekhahla se tlaase sa phetoho.Taba ea pele, DNA e tlameha ho ntšoa ho palo e kholo ea lisampole ka bonngoe, ebe liphatsa tsa lefutso tsa kantle ho naha li tla bonoa ke PCR.Leha ho le joalo, hangata liphetho ha li na letho le lihlopha tse nang le lintho tse 'maloa ka linako tse ling, empa ho ke ke ha khoneha ho tseba hore na ho na le lintho tse sibolotsoeng kapa ho fumanoa ka bohata..Na ho hloka thuso ho tobana le ts'ebetso e joalo ea liteko le liphello?Seke oa tšoenyeha, mor'eso o u ruta mokhoa oa ho lekola limela tsa transgenic positive habonolo le ka nepo.

Mohato oa 1

Li-primer tsa ho lemoha moralo

Etsa qeto ea mofuta oa endogenous le exogenous gene e tla fumanoa ho latela sampole e lokelang ho lekoa, 'me u khethe tatellano ea 100-500bp ho mofuta bakeng sa moralo oa primer.Li-primers tse ntle li ka netefatsa bonnete ba liphetho tsa ho sibolloa le ho khutsufatsa nako ea ho lemoha (sheba sehlomathiso bakeng sa li-primers tse sebelisoang hangata).

Tlhokomeliso: Li-primers tse sa tsoa qaptjoa li hloka ho ntlafatsa maemo a karabelo le ho netefatsa ho nepahala, ho nepahala le moeli oa ho sibolla pele o fumanoa ka bongata.

Mohato oa 2

Etsa protocol ea liteko

Taolo e ntle: Sebelisa DNA e hloekisitsoeng e nang le sekhechana sa sepheo e le template ho fumana hore na tsamaiso le maemo a PCR a tloaelehile.

Taolo e mpe/e se nang letho: Sebelisa template ea DNA kapa ddH2O e se nang sekhechana se lebeletsoeng e le template ho bona hore na ho na le mohloli oa tšilafalo tsamaisong ea PCR.

Taolo ea litšupiso tsa ka hare: sebelisa motsoako oa primer/probe oa mofuta oa endogenous oa sampole ho lekoa ho lekola hore na thempleite e ka bonoa ke PCR.

Tlhokomeliso:

Litaolo tse ntle, tse mpe / tse se nang letho le litaolo tsa ka hare li lokela ho behoa tekong e 'ngoe le e 'ngoe ho hlahloba bonnete ba liphetho tsa liteko.

Ho itokisetsa liteko

Pele o sebelisoa, hlokomela hore na tharollo e tsoakane ka ho lekana.Haeba pula e fumanoa, e hloka ho qhibiliha ebe e tsoakoa ho latela litaelo pele e sebelisoa.Motsoako oa 2 × PCR o hloka ho tšeloa ka pipette le ho kopanngoa khafetsa le micropipette pele o sebelisoa ho qoba kabo e sa lekaneng ea ion.

Tlhokomeliso:

Ntša bukana ea tataiso 'me u e bale ka hloko, 'me u etse litokisetso pele ho teko ho latela litlhoko tsa bukana.

Mohato oa 4

Lokisetsa sistimi ea karabelo ea PCR

Ho ea ka protocol ea liteko, kopanya li-primers, H2O, le 2 × PCR kopanya ka ho lekana, centrifuge 'me u li abele ho tube e' ngoe le e 'ngoe ea karabelo.

Tlhokomeliso:

Bakeng sa tlhahlobo e kholo kapa ea nako e telele, ho khothaletsoa ho sebelisa sistimi ea karabelo ea PCR e nang le enzyme ea UNG, e ka qobang tšilafalo ea aerosol e bakoang ke lihlahisoa tsa PCR.

Mohato oa 5

Kenya template ea karabelo

U sebelisa theknoloji ea Direct PCR, ha ho na tlhoko ea ts'ebetso ea tlhoekiso e tenang ea nucleic acid, template ea sampole e ka lokisoa nakong ea metsotso e 10, 'me sistimi e tsamaisanang le PCR e ka eketsoa.

Tlhokomeliso:

Mokhoa oa cleavage o na le phello e ntle ea ho lemoha, 'me sehlahisoa se fumanoeng se ka sebelisoa bakeng sa karabelo e mengata ea ho lemoha.

5.1: Katoloso e tobileng ea makhasi

Ho ea ka boholo ba setšoantšo se bukeng, khaola lesela la makhasi ka bophara ba 2-3mm 'me u le behe tsamaisong ea PCR.

Tlhokomeliso: Netefatsa hore likhechana tsa makhasi li qoelisoa ka botlalo ka har'a tharollo ea PCR, 'me u se ke ua eketsa mahlaku a mangata a makhasi.

5.2: Mokhoa oa ho arola makhasi

Khaola lesela la makhasi ka bophara ba 5-7mm 'me u le behe ka har'a tube ea centrifuge.Haeba u khetha makhasi a holileng, ka kopo qoba ho sebelisa lisele tsa mothapo o moholo oa lekhasi.Pipette 50ul Buffer P1 lysate ka har'a tube ea centrifuge ho etsa bonnete ba hore lysate e ka qoelisa lesela la makhasi ka ho feletseng, e e behe ka har'a sebaesekele sa mocheso kapa bateng ea tšepe, 'me e lise ka 95 ° C metsotso e 5-10.

Kenya 50ul Buffer P2 neutralization tharollo 'me u kopanye hantle.Lysate e hlahisoang e ka sebelisoa e le template mme ea eketsoa ho sistimi ea karabelo ea PCR.

Tlhokomeliso: Palo ea template e pakeng tsa 5-10% ea tsamaiso ea PCR, 'me ha ea lokela ho feta 20% (mohlala, tsamaisong ea 20μl PCR, eketsa 1-2μl ea tharollo ea lysis, eseng ho feta 4μl).

Mohato oa 6

Boitšoaro ba PCR

Kamora ho kenya methapo ea methapo ea PCR ka bohareng, e beoa sesebelisoa sa PCR bakeng sa ho holisa.

Tlhokomeliso:

Karabelo e sebelisa template e sa hloekisoang bakeng sa ho holisa, kahoo palo ea lipotoloho tsa amplification ke li-cycle tse 5-10 ho feta ha u sebelisa template ea DNA e hloekisitsoeng.

Mohato oa 7

Ho fumanoa ha electrophoresis le ho hlahloba liphello

M: 100bp DNA Lere

1\4: Mokhoa o hloekisitsoeng oa DNA

2\5: Mokhoa o tobileng oa PCR

3\6: Taolo e se nang letho

QC:

Liphetho tsa liteko tsa litsamaiso tse fapaneng tse behiloeng tekong li lokela ho kopana le maemo a latelang.Ho seng joalo, sesosa sa bothata se lokela ho hlahlojoa, 'me tlhahlobo e lokela ho etsoa hape ka mor'a hore bothata bo felisoe.

Letlapa la 1. Liphetho tse tloaelehileng tsa liteko tsa lihlopha tse fapaneng tsa taolo

* Ha plasmid e sebelisoa e le taolo e nepahetseng, sephetho sa tlhahlobo ea lefutso e ka ba mpe

Kahlolo ea sephetho:

K. Sephetho sa tlhahlobo ea mofuta oa endogenous oa sampole ke se fosahetseng, e leng se bontšang hore DNA e loketseng ho fumanoa ha PCR e ke ke ea ntšoa sampoleng kapa DNA e ntšitsoeng e na le PCR reaction inhibitors, 'me DNA e lokela ho ntšoa hape.

B. Sephetho sa tlhahlobo ea mofuta oa endogenous oa sampole ke positive, 'me sephetho sa tlhahlobo ea exogenous gene ke negative, se bontšang hore DNA e loketseng ho fumanoa ha PCR e ntšitsoe sampoleng, 'me ho ka ahloloa hore mofuta oa XXX ha o fumanoe sampoleng.

C. Sephetho sa tlhahlobo ea mofuta oa endogenous oa sampole e ntle, 'me tlhahlobo ea mofuta oa exogenous e ntle, e bonts'a hore DNA e loketseng ho fumanoa ha PCR e ntšitsoe sampoleng,' me sampole ea DNA e na le mofuta oa XXX.Liteko tsa netefatso li ka etsoa hape.

Mohato 8

Li-primer tsa ho lemoha moralo

Ka mor'a teko, sebelisa tharollo ea 2% ea sodium hypochlorite le 70% ea tharollo ea ethanol ho hlakola sebaka sa liteko ho thibela tšilafalo ea tikoloho.