1. Tsebo ea motheo (haeba u batla ho bona karolo ea liteko, ka kopo fetisetsa ka ho toba karolong ea bobeli)
Joalo ka karabelo e tsoang ho PCR e tloaelehileng, PCR ea nako ea 'nete e beha leihlo phetoho ea palo ea sehlahisoa sa amplification potolohong e' ngoe le e 'ngoe ea karabelo ea amplification ea PCR ka nako ea nnete ka phetoho ea lets'oao la fluorescence, 'me ka bongata e sekaseka template ea ho qala ka kamano lipakeng tsa boleng ba ct le curve e tloaelehileng.
Lintlha tse khethehileng tsa RT-PCR kemotheo, moeli oa fluorescenceleCt boleng.
| motheo: | Boleng ba fluorescence ea potoloho ea 3-15 ke motheo (motheo), o bakoang ke phoso ea nako le nako ea tekanyo. |
| Moeko (moeko): | E bua ka moeli oa ho lemoha ha fluorescence o behiloeng sebakeng se loketseng sebakeng sa kholo ea exponential ea curve ea amplification, ka kakaretso makhetlo a 10 ho kheloha ho tloaelehileng ea motheo. |
| CT boleng: | Ke palo ea li-cycle tsa PCR ha boleng ba fluorescence ho tube e 'ngoe le e' ngoe ea karabelo e fihla monyako. Theko ea Ct e ipapisitse le palo ea template ea pele. |
Mekhoa e tloaelehileng ea ho tšoaea RT-PCR:
| mokhoa | molemo | khaello | bophara ba kopo |
| SYBR GreenⅠ | Ts'ebeliso e pharaletseng, e hlokolosi, e theko e tlase ebile e bonolo | Litlhoko tsa pele li phahame, li atisa ho ba le lihlopha tse sa khetheheng | E loketse tlhahlobo ea palo ea mefuta e fapaneng e shebiloeng, lipatlisiso mabapi le polelo ea liphatsa tsa lefutso, le lipatlisiso ka liphoofolo le limela tse sa tsoaneng tse sa bonahaleng. |
| TaqMan | E ikhethang e ntle le ho pheta-pheta ho phahameng | Theko e phahame mme e loketse feela lipakane tse itseng. | Ho lemoha likokoana-hloko, lipatlisiso tsa liphatsa tsa lefutso tsa lithethefatsi, tlhahlobo ea katleho ea lithethefatsi, tlhahlobo ea mafu a lefutso. |
| lebone la molek'hule | Boikhethelo bo phahameng, fluorescence, bokaholimo bo tlase | Theko e phahame, e loketse feela morero o itseng, moralo o thata, 'me theko e phahame. | Tlhahlobo e khethehileng ea liphatsa tsa lefutso, tlhahlobo ea SNP |
2. Mehato ea liteko
2.1 Mabapi le sehlopha sa liteko- ho tlameha ho ba le liliba tse ngata sehlopheng, 'me ho tlameha ho ba le pheta-pheto ea likokoana-hloko.
| ① | Taolo e se nang letho | E sebelisoa ho bona boemo ba kholo ea lisele litekong |
| ② | Taolo e mpe siRNA (tabelo e sa tobang ea siRNA) | Bontša ho nepahala ha ketso ea RNAi.siRNA e ka baka karabelo e sa tobang ea khatello ea maikutlo maemong a 200nM. |
| ③ | Transfection Reagent Control | Se kenyeletse chefo ea sesebelisoa sa phetisetso ho lisele kapa phello ea polelo ea mofuta oa lefutso |
| ④ | siRNA khahlano le lefutso la sepheo | Beha polelo ea mofuta oa lefutso |
| ⑤ (ha u rata) | siRNA e ntle | E sebelisetsoa ho rarolla mathata a tsamaiso ea liteko le ts'ebetso |
| ⑥ (boikhethelo) | Taolo ea fluorescent siRNA | Matla a phetiso ea lisele a ka bonoa ka microscope |
2.2 Melao-motheo ea moralo oa pele
| Boholo bo matlafalitsoeng ba sekhechana | Ka ho khetheha ho 100-150bp |
| Primer Length | 18-25bp |
| Litaba tsa GC | 30% -70%, haholo-holo 45% -55% |
| Tm boleng | 58-60 ℃ |
| Tatelano | Qoba T / C e tsoelang pele;A/G e tsoelang pele |
| 3 qetellong tatelano | Qoba GC ruileng kapa AT ruileng;setsi sa ho qetela ke G kapa C;ho molemo ho qoba T |
| Tlatsetso | Qoba tatellano e tlatsanang ea metheo e fetang 3 ka har'a primer kapa lipakeng tsa li-primers tse peli |
| Tse khethehileng | Sebelisa blast search ho netefatsa lintlha tsa mantlha |
①SiRNA e ikhethile ka mefuta, 'me tatellano ea mefuta e fapaneng e tla fapana.
②SiRNA e phuthetsoe ka phofo e omisitsoeng ka leqhoa, e ka bolokoang ka mokhoa o tsitsitseng bakeng sa libeke tse 2-4 mocheso oa kamore.
2.3 Lisebelisoa kapa li-reagents tse hlokang ho lokisoa esale pele
| Primer (tšupiso ea ka hare) | Ho kenyeletsoa pele le morao tse peli |
| Li-primers (liphatsa tsa lefutso) | Ho kenyeletsoa pele le morao tse peli |
| Target Si RNA (likotoana tse 3) | Ka kakaretso, k'hamphani e tla kopanya likhoele tse 3, ebe e khetha e 'ngoe ea tse tharo ka RT-PCR |
| Phetiso Kit | Lipo2000 etc. |
| RNA Rapid Extraction Kit | Bakeng sa ho ntša RNA ka mor'a phetiso |
| Rapid Reverse Transcription Kit | bakeng sa motsoako oa cDNA |
| PCR Amplification Kit | 2 × Super SYBR Green qPCR Master Mix |
2.4 Mabapi le litaba tse hlokang ho eloa hloko mehatong e khethehileng ea liteko:
① siRNA phetisetso ea phetisetso
1. Bakeng sa plating, o ka khetha poleiti ea seliba tse 24, poleiti ea seliba sa 12 kapa poleiti ea seliba se 6 (karolelano ea RNA e hlahisitsoeng selibeng se seng le se seng sa 24-liliba ke hoo e ka bang 100-300 ng/uL), 'me boholo bo nepahetseng ba phetisetso ea lisele bo fihla ho 60 % -80% kapa joalo.
2. Mehato ea phetisetso le litlhoko tse khethehileng li lumellana ka thata le litaelo.
3. Ka mor'a phetisetso, mehlala e ka bokelloa ka hare ho lihora tsa 24-72 bakeng sa ho lemoha mRNA (RT-PCR) kapa ho fumanoa ha protheine nakong ea lihora tse 48-96 (WB)
② Ts'ebetso ea ho ntša RNA
1. Thibela ho silafatsoa ke li-enzyme tse tsoang kantle ho naha.Haholo-holo e kenyelletsa ho roala limaske le liatlana ka thata;ho sebelisa malebela a sterilized pipette le li-tubes tsa EP;metsi a sebelisitsoeng tekong e tlameha ho ba RNase-Free.
2. Ho kgothaletswa ho etsa ka makhetlo a mabeli joalokaha ho boletsoe ka har'a kit e potlakileng ea ho ntša, e leng ho tla hlile ho ntlafatsa bohloeki le chai.
3. Mokelikeli o litšila ha oa lokela ho ama kholomo ea RNA.
③ tekanyo ea RNA
Ka mor'a hore RNA e ntšoe, e ka lekanyetsoa ka ho toba le Nanodrop, 'me palo e fokolang ea ho bala e ka ba tlaase ho 10ng / ul.
④ phetisetso ea phetisetso
1. Ka lebaka la kutloisiso e phahameng ea RT-qPCR, bonyane liliba tsa 3 tse tšoanang li lokela ho etsoa bakeng sa sampuli ka 'ngoe ho thibela Ct e latelang hore e se ke ea fapana haholo kapa SD hore e be khōlō haholo bakeng sa tlhahlobo ea lipalo-palo.
2. Se ke oa hatsetsa le ho qhibiliha Motsoako oa Monghali khafetsa.
3. E 'ngoe le e 'ngoe ea tube / lesoba le tlameha ho nkeloa sebaka ka ntlha e ncha!Se ke oa tsoela pele ho sebelisa ntlha e tšoanang ea pipette ho eketsa lisampole!
4. Filimi e khomaretsoeng ka poleiti ea seliba sa 96 ka mor'a ho eketsa sampuli e hloka ho lokisoa ka poleiti.Ho molemo ho etsa centrifuge pele u e beha mochine, e le hore mokelikeli o leboteng la tube o ka phalla fatše ebe o tlosa li-bubble tsa moea.
⑤Tlhahlobo e tloaelehileng ea curve
| Ha ho nako ea kholo ea logarithmic | Mohlomong template e phahameng haholo |
| Ha ho boleng ba CT | Mehato e fosahetseng ea ho lemoha matšoao a fluorescent; ho senyeha ha li-primers kapa probes - botšepehi ba eona bo ka fumanoa ke PAGE electrophoresis; palo e sa lekaneng ea template; ho senyeha ha litempele - ho qoba ho kenngoa ha litšila le ho qhoqhoa khafetsa le ho qhibiliha ha ho etsoa sampuli; |
| Ct>38 | Katleho e tlase ea amplification;Sehlahisoa sa PCR se telele haholo;likarolo tse fapaneng tsa karabelo li senyeha |
| Linear amplification curve | Li-probe li ka 'na tsa senyeha hanyane ka lebaka la ho qhibiliha khafetsa kapa ho pepesehela khanya nako e telele. |
| Phapang ea likoti tse peli e kholo haholo | Tharollo ea karabelo ha e qhibilihe ka ho feletseng kapa tharollo ea karabelo ha e kopane;bate e futhumetseng ea sesebelisoa sa PCR e silafalitsoe ke lintho tsa fluorescent |
2.5 Mabapi le tlhahlobo ea data
Tlhahlobo ea lintlha tsa qPCR e ka aroloa ka palo e lekanyelitsoeng le palo e felletseng.Mohlala, lisele tsa sehlopha sa kalafo ha li bapisoa le lisele tsa sehlopha sa taolo,
Ke ka makhetlo a makae mRNA ea lefutso la X e fetohang, sena ke palo e lekanyelitsoeng;palo e itseng ea lisele, mRNA ea lefutso la X
Ho na le likopi tse kae, sena ke quantification e felletseng.Hangata seo re se sebelisang haholo ka laboratoring ke mokhoa o lekanyelitsoeng oa palo.Hangata,mokhoa oa 2-ΔΔcte sebelisoa haholo litekong , kahoo mokhoa ona feela o tla hlahisoa ka ho qaqileng mona.
Mokhoa oa 2-ΔΔct: Sephetho se fumanoeng ke phapang ea polelo ea mofuta o lebisitsoeng sehlopheng sa liteko se amanang le mofuta o lebisitsoeng sehlopheng sa taolo.Ho hlokahala hore matla a ho holisa a mofuta o lebisitsoeng le mofuta oa ka hare oa referense a be haufi le 100%, 'me kheloha e lekanyelitsoeng ha ea lokela ho feta 5%.
Mokhoa oa ho bala ke o latelang:
Sehlopha sa taolo ea Δct = ct boleng ba gene ea sepheo sehlopheng sa taolo - ct boleng ba mofuta oa ka hare oa litšupiso sehlopheng sa taolo
Δct sehlopha sa liteko = boleng ba ct ea mofuta o lebisitsoeng sehlopheng sa liteko - ct boleng ba mofuta oa litšupiso tsa kahare sehlopheng sa liteko
ΔΔct=Δct sehlopha sa liteko-Δct sehlopha sa taolo
Qetellong, bala palo e fapaneng ea phapang boemong ba polelo:
Fetola Fold=2-ΔΔct (e tsamaellanang le tšebetso ea excel ke MATLA)
Lihlahisoa tse amanang:
Nako ea poso: May-20-2023
