Litekong tsa qPCR, moralo oa primer le ona ke sehokelo sa bohlokoa haholo.Hore na li-primers li nepahetse kapa che ho amana haufi-ufi le hore na matla a ho holisa a fihla maemong, hore na lihlahisoa tse holisitsoeng li nepahetse, le hore na liphetho tsa liteko li teng.
Joale u ka etsa joang hore qPCR e be le boleng bo holimo?Matla a phahameng a amplification?
Kajeno, re tla u isa ho rala li-primer tsa qPCR 'moho, 'me u lumelle moralo oa qPCR hore e be tsebo e sebetsang ea lithuto tsa liteko.
Ha ho etsoa li-primers tsa qPCR, hangata ela hloko lintlha tse latelang: li-primers li lokela ho etsoa ho pholletsa le li-introns ka hohle kamoo ho ka khonehang, bolelele ba sehlahisoa e lokela ho ba 100-300 bp, boleng ba Tm bo lokela ho ba haufi ka hohle kamoo ho ka khonehang ho 60 ° C, 'me li-primers tse holimo le tse tlaase li lokela ho ba haufi ka hohle kamoo ho ka khonehang,' me qetellong ea primer e lokela ho ba G kapa C, joalo-joalo.
1. Moralo oa li-primers tse tsamaisang li-introns
Ha u rala li-primer tsa qPCR, ho khetha li-primers tse etselitsoeng li-introns ho ka thibela template ea gDNA ho holisoa, 'me lihlahisoa kaofela li nkiloe ho holisa cDNA, ka hona ho felisa tšusumetso ea tšilafalo ea gDNA.
2. Bolelele ba pele
Bolelele ba primer hangata bo pakeng tsa 18-30 nt, 'me bolelele ba sehlahisoa sa amplification bo lokela ho laoloa pakeng tsa 100-300 bp ka hohle kamoo ho ka khonehang.
Haeba primer e le khutšoanyane haholo, e tla lebisa ho amplification e seng e tobileng, 'me haeba e le telele haholo, e tla theha sebopeho sa bobeli habonolo (joaloka sebopeho sa hairpin).Haeba sehlahisoa sa amplification se le telele haholo, ha sea lokela karabelo ea polymerase, e tla ama bokhoni ba ho holisa PCR.
3. Likahare tsa GC le boleng ba Tm
Likahare tsa GC tsa li-primers li lokela ho laoloa pakeng tsa 40% le 60%.Haeba e phahame haholo kapa e le tlase haholo, ha e thuse ho qala karabelo.Likahare tsa GC tsa li-primers tse eang pele le tse ka morao li lokela ho ba haufi le tse tšoanang e le ho fumana boleng bo tšoanang ba Tm le mocheso o kenang.
Theko ea Tm e lokela ho ba pakeng tsa 55-65 ° C ka hohle kamoo ho ka khonehang, ka kakaretso ho pota 60 ° C, 'me boleng ba Tm ba ho ea holimo le tlaase ho noka e lokela ho ba haufi ka hohle kamoo ho ka khonehang, haholo-holo ho se fete 4°C.
4. Qoba ho khetha A qetellong ea 3′ ea primer
Ha pheletso ea 3′ ea primer e sa lumellane, ho na le phapang e kholo ts'ebetsong ea ts'ebetso ea metheo e fapaneng.Ha setsi sa ho qetela e le A, se ka boela sa qalisa ketane ea ketane esita le tabeng ea ho se lumellane, 'me ha motheo oa ho qetela e le T Ha, katleho ea ho induction e sa lumellaneng e fokotsehile haholo.Ka hona, leka ho qoba ho khetha A qetellong ea 3′ ea primer, 'me ho molemo ho khetha T.
Haeba e le probe primer, qetello ea 5' ea probe e ke ke ea e-ba G, hobane esita le ha setsi se le seng sa G se kopantsoe le sehlopha sa motlalehi oa li-fluorescent tsa FAM, G e ka boela ea tima lets'oao la fluorescent le hlahisoang ke sehlopha sa FAM, ho fella ka liphello tse fosahetseng tse fosahetseng.Hlaha.
5. Kabo ea motheo
Ho ajoa ha metheo e mene ho primer ka mokhoa o ikhethileng, ho qoba ho feta 3 ka tatellano ea G kapa C qetellong ea 3′, le ho feta 3 ka tatellano.G kapa C ho bonolo ho hlahisa lipara sebakeng sa tatellano e ruileng ea GC.
6. Sebaka sa moralo oa primer se lokela ho qoba meaho e rarahaneng ea bobeli.
Sebopeho sa bobeli se entsoeng ke khoele e le 'ngoe ea sehlahisoa sa amplification se tla ama tsoelo-pele e ntle ea PCR.Ka ho bolela esale pele hore na ho na le sebopeho sa bobeli ho tatellano e reriloeng esale pele, leka ho qoba sebaka sena moralong oa li-primers.
7. Li-primer ka botsona le lipakeng tsa li-primers li lokela ho leka ho qoba metheo e tlatsanang e latellanang.
Ha ho na ho ba le tlatsetso ea motheo ea 4 e latellanang pakeng tsa primer ka boeona le primer.The primer ka boeona ha ea lokela ho ba le tatellano e tlatsetsang, ho seng joalo e tla ipata ho etsa sebopeho sa hairpin, se tla ama motsoako oa annealing oa primer le template.
Tatelano e tlatsanang e ke ke ea ba teng lipakeng tsa li-primers tse holimo le tse tlase.Ho tlatsana lipakeng tsa li-primer ho tla hlahisa li-primer dimers, tse tla fokotsa ts'ebetso ea PCR esita le ho ama ho nepahala ha palo.Haeba sebopeho sa primer-dimer le hairpin li ke ke tsa qojoa, boleng ba △G ha boa lokela ho ba holimo haholo (e lokela ho ba ka tlase ho 4.5 kcal/mol).
8. Li-primers li holisa sehlahisoa se ikhethileng.
Sepheo sa ho qetela sa ho lemoha ha qPCR ke ho utloisisa bongata ba lefutso le lebisitsoeng.Haeba amplification e sa khetheheng e etsahala, quantification e tla be e sa nepahala.Ka hona, ka mor'a hore li-primers li qapiloe, li hloka ho hlahlojoa ke BLAST, 'me ho khetheha ha lihlahisoa ho bapisoa le polokelong ea tatellano.
Ka mor'a moo, re nka mofuta oa GAS6 oa motho (Khōlo e ts'oereng 6) e le mohlala oa ho qapa li-primers tsa qPCR.
01 botsa mofuta
Homo GAS6ka NCBI.Mona, re lokela ho ela hloko ho bapisa lebitso la lefutso le mefuta ea tsona ho etsa bonnete ba hore lia lumellana.
02 Fumana tatelano ea lefutso
(1) Haeba tatellano e shebiloeng e le DNA ea genomic, khetha ea pele, e leng tatellano ea DNA ea genomic ea lefutso.
(2) Haeba tatellano ea sepheo e le mRNA, khetha ea bobeli.Kamora ho kenya, tobetsa "CDS" tafoleng e ka tlase.Tatelano ya bokamorao bo sootho ke tatelano ya khouto ya gene.
03 Litlhahiso tsa moralo
Kenya sebopeho sa Primer-BLAST
Kenya nomoro ea tatellano ea liphatsa tsa lefutso kapa tatellano ka sebopeho sa Fasta ka holimo le letšehali, 'me u tlatse li-parameter tse amehang.

Tobetsa "Fumana li-primers" 'me NCBI e tla hlaha ho u joetsa hore khetho e joalo ea paramente e tla phahamisoa ho mefuta e meng ea splicing.Re ka hlahloba mefuta e fapaneng ea ho kopanya 'me ra e romella ho fumana li-primer pair tse loketseng (joalokaha ho bontšitsoe setšoantšong se ka tlase).Ts'ebetso ena e ka nka metsotsoana e mashome ho sebetsa.
Thempereichara ea li-primer pair tsena e pota-pota 60°C.Ho ea ka sepheo sa teko, khetha li-primers tse nang le bolelele bo itekanetseng, boits'oaro bo botle le ho itlhahisa ho fokolang ha li-primers bakeng sa teko, 'me sekhahla sa katleho se phahame haholo!
04 Netefatso ea maemo a mantlha
Ebile, ntle le ho rala li-primers, Primer-Blast e ka boela ea lekola li-primers tseo re iqapetseng tsona.Khutlela leqepheng la moralo oa primer, kenya li-primers tse holimo le tse tlase tseo re li entseng, 'me likarolo tse ling li ke ke tsa fetoloa.Kamora ho romella, o ka bona hore na para ea li-primer le tsona li teng liphatseng tse ling.Haeba kaofela ha tsona li bonts'itsoe ho liphatsa tsa lefutso tseo re batlang ho li hōlisa, ho bontša hore ho hlaka ha para ena ea li-primers ho monate!(Ka mohlala, sena ke sona feela sephetho sa potso ea pele!)

05 Kahlolo ea boleng ba mantlha
Ke mofuta ofe oa primer "e phethahetseng" e kopanyang "bokhoni ba ho holisa ho fihlela maemo", "litšobotsi tse ntlafalitsoeng tsa sehlahisoa", le "liphetho tse tšepahalang tsa liteko"?
Matla a ho holisa

ho qhibidiha
Bokhoni ba ho holisa ba li-primers bo fihla ho 90% -110%, ho bolelang hore bokhoni ba ho holisa bo botle, 'me sekhahla sa ho qhibiliha se na le tlhōrō e le' ngoe 'me hangata Tm> 80 ° C, ho bolelang hore ho nepahala ha amplification ho molemo.
 
Lihlahisoa tse Amanang:
Nako ea 'Nete PCR Easy-SYBR GREEN I
Nako ea 'Nete PCR Easy-Taqman