RT-qPCR ke teko ea mantlha ea baeloji ea limolek'hule, 'me motho e mong le e mong o tlameha ho e tseba.Haholo-holo e kenyelletsa mehato e meraro: ho ntšoa ha RNA, ho ngoloa ka morao ho cDNA, le PCR ea nako ea sebele ea fluorescent quantitative.Ha e thuse, ho etsahalang?Ho ka etsahala hore ebe ho na le bothata kateko ea morao-rao ea mongolo!Leha ho bonahala eka teko ea reverse transcript e hloka feela ho kenyelletsa RNA, dNTP, primers, lereverse transcriptaseho tube ea centrifuge 'me u kopanye hantle, empa ts'ebetsong ea sebele ea ts'ebetso, ho ntse ho e-na le lintlha tse ngata tse lokelang ho lefshoa.A re ithuteng ka eona!

Joang ho ahlola boleng ba RNA?
Ho fumana cDNA, boleng ba RNA bo bohlokoa!Boleng ba RNA bo ka bonoa haholo-holo likarolong tse peli:
(1) Botšepehi ba RNA:Botšepehi ba RNA bo ka netefatsoa ke agarose gel electrophoresis. Ho nka mohlala oa li-eukaryote, kakaretso e feletseng ea RNA e na le lihlopha tse tharo tse hlakileng, boima ba limolek'hule ho tloha ho tse kholo ho ea ho tse nyenyane ke 28S, 18S, le 5S, 'me 28S e khanya habeli ho feta 18S;haeba lihlopha tse tharo li ka bonoa, empa mofuta oa sehlopha o lerootho kapa Phallo e bolela hore RNA e fokotsehile ka mokhoa o itseng.Ka nako ena, ka kopo etsa phetiso e fetoletsoeng hang-hang 'me u eketse mongolo oa template ka nepo;haeba feela sehlopha se nang le boima bo bonyenyane ba molek'hule kapa se sa bonahale, RNA e senyehile ka ho feletseng 'me e hloka ho ntšoa hape.Agilent 2100 e bontša botšepehi ba RNA e nang le setšoantšo se phahameng le boleng ba RIN.Haeba nucleic acid e tiile, motheo oa electropherogram o bataletse;haeba nucleic acid e senyeha haholo, motheo oa motheo o sa lekane 'me litlhōrō tse ngata tsa ho senyeha li hlaha;boleng ba RIN bo bonahatsa botšepehi ba RNA, ka har'a mefuta e fapaneng ea 0-10, boleng bo boholo, boleng ba RNA bo betere.Hantle, tekanyo ea botlalo e phahame.
(2) Bohloeki ba RNA:Karolelano ea OD260/280 e ka bonoa ka UV spectrophotometry.Haeba karolelano ea OD260/280 e pakeng tsa 1.9 le 2.1, bohloeki bo botle haholo.
Residual genomic DNA e ka lebisa liphellong tse sa nepahalang tsa palo
Ha RNA e ntšoa, RNA eo re e fumanang e ka ’na ea tsoakana le genomic DNA (gDNA) e so kang ea hloekisoa.Ka hona, cDNA ka mor'a ho ngoloa ka morao e tla boela e kopane legDNA.Ka nako e tlaseqPCRkarabelo,cDNAle gDNA e ka 'na ea eketsoa ka nako e le' ngoe, e leng se etsang hore ho be le boleng bo fokolang ba CT, kahoo liphello li ka 'na tsa e-ba leeme.
Joale re lokela ho etsa’ng boemong boo?Foregenetlhahiso:
(1) Ho hloekisoa ha liphatsa tsa lefutso ho RNA e khutliselitsoeng morao, e ka tlosoang ka ho ntša likholomo nakong ea ho ntša RNA;
(2) Tšoara RNA e nkiloeng ka DNaseI , empa e felise ka EDTA;
ea reverse transcription reagentska li-module tsa ho hloekisa genome;

U ka khetha li-primers joang bakeng sa reverse transcription?
Litlhahiso tse fetoletsoeng ka morao li boetse li ama sephetho sa mokhoa oa ho fetolela ka morao.U ka khetha li-primers tse sa fetoheng, Oligo dT kapa li-primers tse ikhethileng tsa lefutso bakeng sa khatiso e khutlisetsang morao ho latela maemo a itseng a teko:
(1) Lingoliloeng tse khethehileng: li-primers tse khethehileng tsa lefutso li khothaletsoa;
(2) Likopi tse telele tsa sekhechana: Li-primers tse khethehileng tsa Oligo dT/gene-specific;
(3) Likaroloana tse ka hare tsa likarolo tse telele tse ngotsoeng: li-primers tse khethehileng tsa lefutso / li-primers tse sa reroang / li-primers + Oligo dT.Haeba tlhahlobo e latelang ea qPCR e etsoa, ​​Oligo dT e ke ke ea sebelisoa e le mong, hobane ho sebelisa Oligo dT feela ho ka baka khethollo ea 3 ', e lebisang liphellong tse sa nepahalang tsa liteko tsa qPCR;
(4) miRNA: Li-primer tsa stem-loop kapa li-primer tsa mohatla li ka sebelisoa.

Sehlahisoa sa reverse transcript cDNA se lokela ho hlapolloa ka makhetlo a makae bakeng sa quantification?
Kamora ho fumana cDNA ea sehlahisoa sa reverse transcript, ke makhetlo a makae cDNA e lokelang ho hlapolloa bakeng sa liteko tsa qPCR ho bohlokoa haholo.Haeba mahloriso a cDNA a phahame haholo kapa a le tlase haholo, bokhoni ba ho holisa bo ka ameha.Na mahloriso a cDNA a ka lekanngoa, 'me a lokela ho etsoa joang?
(1) Khatiso ea cDNA ea sehlahisoa sa reverse transcription e ke ke ea lekanyetsoa, ​​hobane ho phaella ho sehlahisoa sa cDNA, sehlahisoa sa reverse transcript se boetse se na le reverse transcript residual Buffer, reverse transcriptase, primers, joalo-joalo, e tla kena-kenana le liphello tsa tekanyo ea mahloriso le ho baka OD260 / 280, OD260 / 230 ka lebaka leo tekanyo ea cDNA e sa bontše.Ka nako ena, metsoalle e meng e tla re, joale ke tla lekanya mahloriso ka mor'a tlhoekiso;Mona, Forgene e rata ho hopotsa hore cDNA ha e khothalletsoe ho hloekisoa, hobane bolelele ba cDNA bo fumanoeng ka ho khutlisa bo fapane, 'me cDNA e khutšoanyane e tla lahleha tlhoekisong.
(2) Joale ho etsoa eng?Pele ho teko ea qPCR, sekhahla sa ho hlapolla sa cDNA se ka khethoa ka teko ea pele.Mohlala: sebelisa cDNA stock solution, 10-fold dilution, le 100-fold dilution e le lithempleite tsa liteko tsa qPCR, 'me u khethe ntlha ea dilution e nang le boleng ba CT ho tloha 18-28.

Li-miRNA li lokela ho ngoloa joang ka morao?
miRNA ke molek'hule e nyenyane ea RNA e nang le makhabane a le mong e boholo ba 22 nt e sa hlokeng protheine.Ka lebaka la bolelele ba eona bo khutšoanyane, mokhoa o tloaelehileng oa qPCR o thata ho o lekanya ka ho toba, kahoo hangata hoa hlokahala ho atolosa miRNA;mekhoa e tloahelehileng e sebelisoang ho reverse transcript bakeng sa miRNA e kenyelletsa mokhoa oa stem-loop le mokhoa oa ho hula.
Mokhoa oa stem-loop ke ho atolosa miRNA ka ho eketsa li-primers tsa stem-loop.Mokhoa ona oa ho lemoha o na le kutlo e phahameng le ho nepahala, empa ts'ebetso ea ho lemoha e tlase.Sengoloa se le seng se ka morao se ka lemoha miRNA e le 'ngoe feela le referense ea ka hare;mokhoa oa ho eketsa mohatla o entsoe ka tse peli E phethoa ka ketso e kopanetsoeng ea li-enzyme tse peli, e leng PolyA polymerase le reverse transcriptase.PolyA polymerase e na le boikarabello ba ho kenya mehatla ea PolyA ho miRNA ho eketsa bolelele ba eona, 'me reverse transcriptase e etsa reverse transcript reaction.Mokhoa ona o na le ts'ebetso e phahameng ea ho lemoha 'me o khona ho lemoha li-miRNA tse ngata le litšupiso tsa ka hare ho mongolo o le mong oa reverse, empa kutloisiso le ho khetheha li tlaase ka mokhoa oa stem-loop.