Motho e mong le e mong o bua ka molao-motheo oa teko ea qRT-PCR, moralo oa pele, tlhaloso ea sephetho, joalo-joalo, empa ke nahana hore ke lokela ho arolelana le uena ts'ebetso ea liteko ea qRT-PCR.E nyane, empa e mabapi le liphetho.
Pele re etsa qRT-PCR, re hloka ho ba le kutloisiso e hlakileng ea RNA ea rona le mekhoa ea ts'ebetso.Etsoe, boiteko ba rōna bo reretsoe ho fumana liphello, ho e-na le ho itlhakisa feela.Kahoo pele re etsa qRT-PCR, re hloka ho tseba lintlha tse latelang (tse ling tsa tsona li sebetsa ho SYBR feela).
1 A na u na le bonnete ba hore RNA ea hau ha e fokotsehe?
NanoDrop 2000 e khona ho bona feela ho tsepamisa maikutlo le ho hloeka ha RNA, empa ha e khone ho lemoha botšepehi ba RNA.
Boleng ba RNA (RNA Intesity Number) bo ka bonahatsa botšepehi ba RNA, bo fumanoang ke Agilent 2100 Bioanalyzer system.
Setšoantšo sa setšoantšo sa boleng ba RIN bakeng sa disampole tse fapaneng tsa RNA (eukaryotes)
Leha ho le joalo, lilaboratori ka kakaretso ha li na Agilent 2100 Bioanalyzer.Tabeng ena, re ka lemoha ka gel ea formaldehyde, empa tlhokahalo ea kakaretso ea RNA e phahame, kahoo mokhoa o potlakileng ke ho sebelisa gel electrophoresis e tloaelehileng.Hoa hlokahala ho ba sebakeng se se nang nuclease, kahoo hoa hlokahala ho hlatsoa tanka ea electrophoresis, botlolo ea sol, bracket ea gel le ho kopanya ka metsi a DEPC.Agarose hape ha e na nuclease (ha feela e sa tsoa buloa), 'me Loading Buffer e lokela ho buloa e sa tsoa buloa ka hohle kamoo ho ka khonehang, ka gel ea 1.2%.
Hlokomela hore gel e tlameha ho qhibiliha ka ho feletseng, ho seng joalo e tla baka lihlopha tse sa tšoaneng, joalokaha ho bontšitsoe sampuling ea 9 setšoantšong.Haeba motlakase o phahame haholo kapa o sebetsa nako e telele haholo o tla hlahisa mocheso mme o baka ho senyeha ha RNA, kahoo motlakase le nako li lokela ho laoloa ka mokhoa o utloahalang.Ho phaella moo, ho sebetsa ha gel ho ka boela ha etsa qeto ea hore na ho na le masala a DNA ka har'a sampuli, 'me u hlokomele hore na ho na le lihlopha tse ngata tse bolokiloeng selibeng se fanang ka metsi.
Setšoantšo.Ho fumanoa ha gel electrophoresis ea RNA
2 Na u na le bonnete ba hore cDNA ea hau e na le bokae?
Boiphihlelo ba barab'abo rōna ba baholo ka laboratoring ke hore cDNA ea 20 ul system e fumanoang ke inversion e 'ngoe le e' ngoe e hlapollotsoe ka ho toba 20X, ha baralib'abo rōna ba post-doctoral ba hlapolotsoe 10X.Hangata ke itšetlehile ka boemo.Kaha boleng ba RNA bo boleloang ke motho ka mong bo fapane, boemo ba ho fetoha le bona bo fapane, 'me theknoloji ea ho fetola e ka' na ea se ke ea tsitsa.
Kahoo nako le nako ha ke fumana cDNA e khutliselitsoeng, ke tla qala ho e hlapolla ka makhetlo a ka bang 3, ebe ke sebelisa mofuta oa ho boloka ntlo ho etsa RT-PCR, palo ea lipotoloho ka kakaretso ke lipotoloho tse 25, ho khetholla mahloriso a khethehileng, ebe ke fumana ntlha ea ho qetela ea dilution.
3 Na u na le bonnete ba hore li-primers tsa hau li bonolo ho li sebelisa?
E ka fetisa lebelo le qhibilihang la qRT-PCR, empa sena se ntse se bitsa chelete.Bakeng sa li-laboratories tse se nang chelete e ngata, ha li fumana li-primers tse ngata, li ka sebelisa RT-PCR e tloaelehileng ho bona hore na ke sehlopha se le seng le ho khetholla tse khethehileng tsa li-primers.Haeba laboratori e se na chelete e fokolang, ho hlaka ha li-primers tsohle ho ka tsejoa hang ka sekhahla sa ho qhibiliha.
4 Na u na le bonnete ba hore maemo a hau a liteko a loketse?
SYBR e lokela ho sireletsoa maboneng a matla, kahoo leka ho tima mabone a holimo ha u eketsa SYBR reagent, 'me u hloka feela ho sebelisa leseli le lerootho ho e qeta.
Boloka SYBR ho 4°C.Ha e sebelisoa, ka bonolo fetola holimo le tlase ho kopanya hantle ho qoba ho phophoma, 'me u se ke ua phunya ka matla.
Baralib'abo rōna ba bang ba bacha ba rata ho hula matšoao holim'a boto ea PCR ka lebaka la ho tšaba ho kopanya lisampole, e leng phoso.Hobane matšoao a hau a ka ama pokello ea matšoao a fluorescent, hangata ke khothaletsa bacha ho sebelisa libuka tsa liteko ho thusa mohopolong, joalo ka ha ho bonts'itsoe ka tlase.
Setšoantšo.qRT-PCR lisampole tsa loading diagram
5 Na u na le bonnete ba hore u e etsa hantle?
Etsa bonnete ba ho roala liatlana, ho roala liatlana, ho roala liatlana, le ho bua lintho tsa bohlokoa ka makhetlo a mararo.
E le ho fokotsa ho pepeseha ha SYBR ho khanya, 'na ka bonna ke rata ho eketsa template pele, joalokaha ho bontšitsoe setšoantšong se ka tlase.Ho latela boiphihlelo, ho eketsoa ha template e nyane ho ka baka liphoso tsa sampole.Ka hona, e le ho fokotsa phoso e bakoang ke ho eketsa palo e nyenyane ea template, hangata ke habeli sampuli hape, 'me ke habeli chelete ha ke eketsa sampuli ho fokotsa palo ea H2O2 e ekelitsoeng.
Setšoantšo.Setšoantšo sa moralo oa ho kenya qRT-PCR
Ebe u lokisa sistimi ea qRT-PCR ka tsela e latelang.
Setšoantšo.Setšoantšo sa ho lokisoa ha sistimi ea qRT-PCR
ELA HLOKO: Ts'ebetso ea tlhophiso e tlameha ho etsoa ka leqhoa.
Ka mor'a ho eketsa sampuli, beha filimi e tiisang pepeneneng.Leka hore u se ke ua ama holim'a filimi ea ho tiisa e pepeneneng ka matsoho a hao, feela u sebetse ho tloha sebakeng ka mahlakoreng ka bobeli a filimi.Hobane menoana e ka boela ea ama pokello ea matšoao a fluorescent.Ebe u sebelisa centrifuge ho potlakisa centrifuge bakeng sa 10 s ka lebelo le tlaase ho thibela sampuli ho leketla leboteng.
Lihlahisoa tse Amanang:
Nako ea poso: Apr-28-2023
