1. Kutloisiso ea pele
Mothating ona, re hloka ho utloisisa likhopolo le mantsoe a mang, e le ho qoba ho etsa liphoso ka pel'a batho ba baholo, joalo ka:
P: Phapano ke efe pakeng tsa RT-PCR, qPCR, Real-time PCR, le RT-PCR ea nako ea sebele?
Karabo: RT-PCR ke PCR e fetoletsoeng ka morao(reverse transcription PCR, RT-PCR), e leng mofuta o sebelisoang haholo oa polymerase chain reaction (PCR).Ho RT-PCR, mofuta oa RNA o fetoleloa ka morao ho DNA e tlatselletsang, e sebelisoang e le template ea ho holisa DNA ke PCR.
Nako ea 'nete-PCR le qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) ke ntho e le 'ngoe, ka bobeli ke PCR ea nako ea sebele, e bolelang hore potoloho e' ngoe le e 'ngoe ea PCR e na le litlaleho tsa data tsa nako ea sebele, kahoo palo ea li-templates tse qalang li ka fetoloa tlhahlobo e nepahetseng.
Leha PCR ea Real-time (PCR ea nako ea 'nete ea fluorescent quantitative PCR) le Reverse transcription PCR (reverse transcription PCR) li bonahala li khutsufatsoe e le RT-PCR, kopano ea machaba ke: RT-PCR e bua ka ho qotlisoa ka ho toba.PCR , PCR ea nako ea 'nete hangata e khutsufatsoa e le qPCR (PCR ea nako ea nnete ea bongata).
'Me RT-PCR (RT-qPCR) ea nako ea sebele, Ke PCR e ngotsoeng ka morao e kopantsoeng le theknoloji ea fluorescent quantitative.: fumana pele cDNA (RT) ho tsoa ho RNA reverse transcription, ebe u sebelisa Real-time PCR bakeng sa tlhahlobo ea bongata (qPCR).Lilaboratori tse ngata li etsa RT-qPCR, ke hore, liphuputso mabapi le RNA expression down-regulation, kahoo qPCR eo motho e mong le e mong a buang ka eona ka laboratoring e hlile e bua ka RT-qPCR, empa u seke oa lebala hore ho ntse ho e-na le liteko tse ngata tsa DNA lits'ebetsong tsa bongaka.Tlhahlobo ea palo, joalo ka ho lemoha kokoana-hloko ea hepatitis B HBV.
Potso: Ka mor'a ho bala palo e ngata ea fluorescent quantitative PCR, ke hobane'ng ha sekhechana se atolositsoeng se lokela ho laoloa ka har'a 80-300bp?
Araba: Bolelele ba tatellano e 'ngoe le e' ngoe ea liphatsa tsa lefutso bo fapane, tse ling li na le kb tse 'maloa, tse ling ke makholo a bp, empa re hloka feela hore bolelele ba sehlahisoa bo be 80-300bp ha ho etsoa li-primers, tse khutšoanyane haholo kapa tse telele haholo ha li tšoanelehe bakeng sa ho fumanoa ha fluorescent quantitative PCR .Sekhechana sa sehlahisoa se khuts'oane haholo hore se ka khetholloa ho primer-dimer.Bolelele ba primer-dimer ke hoo e ka bang 30-40bp, 'me ho thata ho khetholla hore na ke primer-dimer kapa sehlahisoa haeba e ka tlase ho 80bp.Haeba sekhechana sa sehlahisoa se le telele haholo, se feta 300bp, se tla lebisa katlehong e tlase ea amplification 'me e ke ke ea khona ho lemoha ka nepo palo ea liphatsa tsa lefutso.
Mohlala, ha u bala hore na ke batho ba bakae ka phaposing ea borutelo, u hloka feela ho bala hore na ho na le melomo e mekae.Ho joalo le ha u lemoha liphatsa tsa lefutso, u hloka feela ho lemoha tatellano e itseng ea lefutso ho emela Letoto lohle le tla etsa.Haeba u batla ho bala batho, u lokela ho bala melomo le linko, litsebe le likhalase, 'me ho bonolo ho etsa liphoso.
Ho holisa, lipatlisisong tsa baeloji, ho na le linyeoe tse ngata tsa lipatlisiso ho tloha sebakeng se seng ho ea ho se seng, hobane tatellano ea liphatsa tsa lefutso ea mofuta ofe kapa ofe e telele haholo, ha ho hlokahale ebile ha ho khonehe ho lekanya likhechana tsohle, joalo ka tatellano ea baktheria 16S, e leng ho etsa tatellano e bolokehileng ea libaktheria Assays ho fumana palo ea palo e itseng ea libaktheria.
Q: Ke bolelele bofe bo nepahetseng bakeng sa moralo oa qPCR?
Araba: Ka kakaretso, bolelele ba primer bo ka bang 20-24bp, e leng molemo.Ehlile, re tlameha ho ela hloko boleng ba TM ba primer ha re rala primer, hobane sena se amana le mocheso o nepahetseng oa annealing.Kamora liteko tse ngata, ho netefalitsoe hore 60 ° C ke boleng bo betere ba TM.Haeba mocheso oa li-annealing o le tlase haholo, o tla lebisa ho matlafatso e sa khetheheng habonolo.Haeba mocheso oa annealing o phahame haholo, katleho ea ho holisa e tla ba tlase haholo, tlhoro ea sekhahla sa amplification e tla qala hamorao, 'me boleng ba CT bo tla lieha.
P: Mokhoa oa dae o fapane joang le oa probe?
Karabo: Mokhoa oa ho daeaLidae tse ling tsa fluorescent, tse kang SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, joalo-joalo, ha li hlahise khanya ka botsona, empa li tla ntša fluorescence ka mor'a hore li tlamelle groove e nyenyane ea DNA e nang le likarolo tse peli.Ka hona, qalong ea karabelo ea PCR, mochine ha o khone ho lemoha letšoao la fluorescent.Ha karabelo e fihla mothating oa katoloso, mohala o habeli oa buloa, 'me khoele e ncha e etsoa tlas'a ketso ea DNA polymerase,' me molek'hule ea fluorescent e tlama ho dsDNA minor groove.Ha palo ea lipotoloho tsa PCR e ntse e eketseha, lidae tse ngata li kopantsoe le DNA e nang le likhoele tse peli, 'me lets'oao la fluorescent le lona le ntse le ntlafatsoa khafetsa.Mokhoa oa dae o sebelisoa haholo liphuputsong tsa saense.
PS: Ela hloko ha u etsa teko, dae e tlameha ho kopanngoa le DNA ea motho, e-ba hlokolosi ho e fetola motho oa fluorescent.
Mokhoa oa ho daea (ka ho le letšehali) Mokhoa oa ho hlahloba (ka ho le letona)
PS: Ela hloko ha u etsa teko, dae e tlameha ho kopanngoa le DNA ea motho, e-ba hlokolosi ho e fetola motho oa fluorescent.
SYBR Green Ⅰ e hokahana le groove e nyane ea DNA
Mokhoa oa ho hlahlobaTaqman probe ke mokhoa o sebelisoang haholo oa hydrolysis.Ho na le sehlopha sa fluorescent qetellong ea 5′ ea probe, hangata FAM, 'me probe ka boeona ke tatellano e tlatsanang le lefutso le lebisitsoeng.Ho na le sehlopha se timang fluorescent qetellong ea 3′.Ho ea ka molao-motheo oa phetiso ea matla a fluorescence resonance (Förster resonance energy transfer, FRET), ha motlalehi oa sehlopha sa fluorescent (molek'hule ea fluorescent ea mofani) le sehlopha sa quenching fluorescent (molek'hule ea amohelang fluorescent) lia thaba , ha autofluorescence e fokola.Ka hona, qalong ea karabelo ea PCR, ha probe e lokolohile 'me e tiile tsamaisong, sehlopha sa motlalehi oa fluorescent se ke ke sa ntša fluorescence.Ha o anneal, primer le probe li tlamella template.Nakong ea katoloso, polymerase e tsoela pele ho kopanya liketane tse ncha.DNA polymerase e na le ts'ebetso ea 5'-3' ea exonuclease.Ha e fihla ho probe, DNA polymerase e tla etsa hydrolyze probe ho tloha template, e arole sehlopha sa moqolotsi oa fluorescent ho sehlopha sa quencher fluorescent, ebe e lokolla lets'oao la fluorescent.Kaha ho na le kamano e le 'ngoe pakeng tsa probe le template, mokhoa oa ho hlahloba o phahametse mokhoa oa dae ho latela ho nepahala le kutloisiso ea tlhahlobo.Mokhoa oa ho hlahloba o sebelisoa haholo-holo ho hlahloba.
P: quantification e felletseng ke eng?Relative Quantification ke eng?
Araba: Palo e felletseng e bua ka palo ea palo ea kopi ea pele ea sampole e tla hlahlojoa ke qPCR, joalo ka hore na ke livaerase tse kae tsa HBV tse 1ml ea mali.Sephetho se fumanoeng ka palo e lekanyelitsoeng ke phetoho ea palo ea liphatsa tsa lefutso tse shebiloeng sampoleng e itseng e amanang le sampole e 'ngoe ea litšupiso, 'me polelo ea liphatsa tsa lefutso e laoloe holimo kapa e theohile.
P: Na palo ea RNA e ntšitsoeng, ho khutlisa katleho ea khatiso, le bokhoni ba ho holisa li tla ama sephetho sa liteko?
P: Na mohlala oa polokelo, li-reagents tsa ho ntša, li-reagents tsa reverse transcription, le lisebelisoa tse fetisang leseli li tla ama sephetho sa liteko?
P: Ke mokhoa ofe o ka lokisang data ea liteko?
Mabapi le litaba tsena, re tla li hlalosa ka botlalo likarolong tse tsoetseng pele le tse tsoetseng pele tse ka tlase.
2. Tsebo e tsoetseng pele
Mabapi le PCR ea nako ea nnete ea fluorescent quantitative, re tlameha ho lemoha 'nete ea hore likete tsa lipampiri tsa lipatlisiso tsa saense li hatisoa selemo se seng le se seng, tseo har'a tsona theknoloji ea PCR ea fluorescent e seng palo e nyenyane.
Haeba ho se na maemo a tloaelehileng a ho lekanya teko ea fluorescent quantitative PCR, liphetho li ka fapana haholo.Bakeng sa mofuta o tšoanang oa mofuta o tšoanang, o nang le mokhoa o ts'oanang oa ts'ebetso, liphetho tsa ho lemoha le tsona li tla fapana haholo, 'me ho tla ba thata ho ba liehang ho pheta liphetho tse tšoanang.Uena Ha ho motho ea tsebang se nepahetseng le se fosahetseng.
Na see se bolela hore fluorescent quantitative PCR ke thekenoloji ea bolotsana kapa theknoloji e sa tšepahaleng?Che, ke hobane fluorescent quantitative PCR e hlokolosi haholoanyane ebile e nepahetse, 'me ts'ebetso e fosahetseng e nyane e tla hlahisa liphetho tse fapaneng ka ho felletseng.Tahlehelo e nyane e bohole ba limaele tse sekete.Mongoli oa sengoloa a ka 'na a hlokofatsoa khafetsa ke bahlahlobi.Ka nako e ts'oanang, bahlahlobi ba koranta le bona ba thata ho khetha ho tsoa ho liphetho tse fapaneng tsa liteko.
Ka kakaretso, ho supa khaello ea tumellano litekong tsa nako ea nnete tsa PCR.Ho fihlela sena, bo-rasaense ba phahameng indastering ba ile ba qala ho theha litekanyetso,e hloka hore batšehetsi ba fane ka lintlha tse hlokahalang tsa liteko le ts'ebetso ea data (ho kenyeletsoa le data e hlokahalang) sengolong ho fihlela maemo ana.
Bahlahlobi ba ka ahlola boleng ba teko ka ho bala lintlha tsena;babali ba kamoso le bona ba ka sebelisa sena ho pheta teko kapa ho ntlafatsa teko.Joale liphetho tsa liteko tse fumanoeng ka tsela ena li tletse tlhahisoleseling, boleng ba boleng bo holimo, ebile li ka sebelisoa.
MIBBI (Bonyane Boitsebiso bakeng sa Patlisiso ea Baeloji le Botho -http://www.mibbi.org) e hlahile.MIBBI ke projeke e fanang ka litekanyetso tsa liteko.E phatlalalitsoe ka tlhaho.Morero ona o reretsoe liteko tse fapaneng tsa baeloji, ho kenyeletsoa baeloji ea lisele, Microarray, qPCR eo re tlil'o bua ka eona hona joale, joalo-joalo, 'me e fana ka mofuta o mong le o mong oa liteko ha o fana ka libuka tse ngotsoeng ka letsoho.Boitsebiso boo bo lokela ho fanoa ka linako tsohle.
Morerong oa MIBBI, ho na le lingoloa tse peli tse amanang le fluorescent quantitative PCR, e leng.:
·RDML (Puo ea Nako ea 'Nete ea PCR Data Markup) - puo e hlophisitsoeng le tataiso ea tlaleho bakeng sa data ea nako ea sebele ea PCR;
·MIQE (Bonyane Bonyane bakeng sa Phatlalatso ea Liteko tsa PCR tsa Quantitative Real-Time) – bonyane lintlha tsa ho phatlalatsa lingoliloeng tse mabapi le liteko tsa nako ea nnete tsa PCR.
Taba ea pele, ha re bue ka RDML, tlhaloso ea mantsoe.
Haeba ho se na tlhaloso e tloaelehileng bakeng sa ntho e 'ngoe le e' ngoe, ho ke ke ha khoneha ho tsoela pele moqoqong, ke ka lebaka leo tlhaloso ea mantsoe e leng ea bohlokoa ha ho hlahlojoa.
Mareo a sebelisitsoeng tekong ea fluorescent quantitative PCR a kenyelletsa litaba tse latelang.QIAGEN e re etselitse kakaretso e ntle ka ho fetisisa.Tse latelang li omme kaofelathepa .
Mokokotlo oa ho phahamisa
Mokokotlo oa amplification o bua ka lekhalo le entsoeng nakong ea ts'ebetso ea PCR, ka nomoro ea potoloho e le abscissa le matla a nako ea nnete a fluorescence nakong ea karabelo e le ordinate.
Sekhahla se setle sa amplification se lokela ho ba le litšobotsi tse latelang: motheo o bataletse kapa o fokotsehile hanyenyane, 'me ha ho na mokhoa o totobetseng oa ho ea holimo;ntlha ea inflection ea mothinya e hlakile, 'me moepa oa sekhahla sa exponential o lekana le bokhoni ba ho holisa.Ha moepa o le moholo, matla a ho holisa a phahame;kakaretso ea amplification curve The parallelism e ntle, e bontšang hore katleho ea amplification ea tube ka 'ngoe e tšoana;karolo ea exponential ea curve amplification ea lisampole tse tlaase-concentration e totobetse.
Baseline (Baseline)
Taba ea mantlha ke boemo ba lerata la potoloho ea pele, hangata e lekanngoa pakeng tsa 3rd le 15th cycle, hobane keketseho ea boleng ba fluorescence e bakoang ke sehlahisoa sa amplification e ke ke ea fumanoa nakong ena.Palo ea lipotoloho tse sebelisetsoang ho bala motheo e ka fapana 'me e ka hloka ho fokotsoa haeba ho sebelisoa lipalo tse phahameng tsa thempleite kapa boemo ba polelo ea mofuta o lebeletsoeng bo le holimo.
Ho beha motheo ho hloka ho shebella data ea fluorescence ho tsoa ho curve ea amplification ea linearity.Mokhahlelo oa motheo o behiloe e le hore ho hōla ha sekhahla sa amplification ho qale ka nomoro ea potoloho e kholo ho feta palo e ka holimo ea potoloho ea motheo.Metheo e tlameha ho beoa ka bonngoe bakeng sa tatelano e 'ngoe le e 'ngoe ea sepheo.Karolelano ea litekanyetso tsa fluorescence tse fumanoeng nakong ea lipotoloho tsa pele li hloka ho tlosoa ho litekanyetso tsa fluorescence tse fumanoang lihlahisoa tse matlafalitsoeng.Liphetolelo tsa morao-rao tsa software e fapaneng ea Real-Time PCR li lumella ho ikamahanya le maemo a mantlha bakeng sa lisampole ka bomong.
Nakong ea lipotoloho tse 'maloa tsa pele tsa karabelo ea amplification ea PCR, lets'oao la fluorescence ha le fetohe haholo.Ho atamela mola o otlolohileng ho bitsoa motheo, empa ha re sheba ka hloko lipotoloho tse 'maloa tsa pele, re bona hore ka hare ho motheo ke se etsahalang setšoantšong se ka tlase.
Background Background e bua ka
boleng bo sa tobang ba fluorescence karabelong .Mohlala: ho tima fluorescence e sa sebetseng hantle;kapa palo e kholo ea litempele tsa DNA tse habeli ka lebaka la tšebeliso ea SYBR Green.Likarolo tse ka morao tsa lets'oao li tlosoa ka lipalo ke algorithm ea software ea Real-Time PCR.
Lets'oao la moqolotsi
Letšoao la motlalehi le bua ka lets'oao la fluorescent le hlahisoang ke SYBR Green kapa li-probes tse ngotsoeng ka tatellano e khethehileng nakong ea Real-Time PCR.
Letšoao la Motlalehi le Tloaelehileng (RN)
RN e bua ka matla a fluorescence a dae ea moqolotsi e arotsoeng ke matla a fluorescence a dae e sa sebetseng e lekantsoeng potolohong ka 'ngoe.
Passive Reference Dae
Li-PCR tse ling tsa Nako ea 'Nete,dae ea fluorescent ROX e sebelisoa e le sesupo sa kahare ho tloaeleha lets'oao la fluorescent.E lokisa liphapang ka lebaka la liphaephe tse sa nepahalang, boemo ba seliba, le ho feto-fetoha ha fluorescence ka mokhoa o nepahetseng hantle.
Mohaho oa fluorescence (mohaho)
e ile ea lokisoa ka holim'a boleng ba bokamorao 'me haholo ka tlase ho boleng ba sehlaba sa curve ea amplification.E tlameha ho ba sebakeng se otlolohileng sa curve ea amplification, e emelang letoto la li-log-linear la ho lemoha PCR.Li-threshold li lokela ho hlophisoa ponong ea curve ea logi-amplification hore karolo ea log-linear ea PCR e bonahale habonolo.Haeba ho na le mefuta e mengata ea liphatsa tsa lefutso ho Real-Time PCR, ho tlameha hore ho behoe menahano bakeng sa sepheo se seng le se seng .Ka kakaretso, lets'oao la fluorescence la lipotoloho tsa pele tse 15 tsa karabelo ea PCR le sebelisoa joalo ka lets'oao la mokokotlo oa fluorescence, 'me moeli oa fluorescence ke makhetlo a 10 ho kheloha ho tloaelehileng ha lets'oao la fluorescence la li-cycle tsa pele tse 3 ho isa ho tse 15 tsa PCR,' me moeli oa fluorescence o behiloe karolong ea amponplential ea PC.Ka kakaretso, sesebelisoa se seng le se seng se na le moeli oa fluorescence pele se sebelisoa.
Cycle Threshold (CT) kapa Crossing Point (CP)
Potoloho eo curve ea amplification e tšelang moeli (ke hore, sebaka seo ho bona ha fluorescence ho eketsehang haholo).CT e ka ba karoloana 'me palo ea template ea ho qala e ka baloa.Boleng ba CT bo emela palo ea lipotoloho tse bang teng ha lets'oao la fluorescent ho tube e 'ngoe le e' ngoe ea karabelo ea PCR e fihla moeling o behiloeng.Ho na le kamano pakeng tsa boleng ba CT ba template ka 'ngoe le logarithm ea nomoro ea pele ea kopi ea template,ho phahamisa nomoro ea pele ea kopi, e nyane ea boleng ba CT, le ka tsela e fapaneng.Mokokotlo o tloaelehileng o ka etsoa ka ho sebelisa tekanyo e nang le nomoro ea kopi ea pele e tsejoang, moo abscissa e emelang boleng ba CT, 'me ordinate e emela logarithm ea nomoro ea pele ea kopi.Ka hona, hafeela tekanyo ea CT ea sampuli e sa tsejoeng e fumanoa, palo ea pele ea kopi ea sampuli e ka baloa ho tloha mokhoeng o tloaelehileng.
ΔCT boleng
ΔCT boleng bo hlalosaphapano lipakeng tsa mofuta o shebiloeng le boleng bo lumellanang ba mofuta oa referense oa CT, joalo ka mofuta oa tlhokomelo ea ntlo, 'me e sebelisetsoa ho tloaeleha palo ea template e sebelisoang:
⇒ΔCT = CT (phatsa ea lefutso) - CT (endogenous reference gene)
ΔΔCT Boleng
Theko ea ΔΔCT e hlalosa phapang lipakeng tsa boleng bo boleloang ba ΔΔCT ba sampole ea thahasello (mohlala, lisele tse hlasimollang) le boleng bo bolelang ΔΔCT ba sampole ea litšupiso (mohlala, lisele tse sa hlohlelletsoang).Mohlala oa litšupiso o boetse o bitsoa sampole ea calibration mme disampole tse ling kaofela li tloaeleha ho sena bakeng sa palo e lekanyelitsoeng:
⇒ΔΔCT = karolelano ΔCT (mohlala oa thahasello) - karolelano ΔCT (sampuli ea litšupiso)
Liphatsa tsa lefutso tsa endogenous (liphatsa tsa lefutso tsa endogenous)
Maemo a polelo a liphatsa tsa lefutso tsa endogenous reference, joalo ka liphatsa tsa lefutso tsa tlhokomelo ea ntlo (liphatsa tsa tlhokomelo ea ntlo), ha li fapane lipakeng tsa lisampole.Ho bapisa litekanyetso tsa CT tsa mofuta oa litšupiso ho mofuta o lebisitsoeng ho lumella boemo ba polelo ea mofuta o lebisitsoeng ho tloaeleha ho ea ho palo ea RNA kapa cDNA e kentsoeng (sheba karolo ea ΔCT boleng bo kaholimo).
Liphatsa tsa lefutso tsa ka hare li nepahetse bakeng saho senyeha ho ka bang teng ha RNA kapa ho ba teng ha li-enzyme inhibitors ho lisampole tsa RNA, hammoho le ho fapana ha litaba tsa RNA, ho sebetsa hantle ha transcript, ho hlaphoheloa ha nucleic acid, le ho tšoara sampole.Ho khetha mofuta o nepahetseng oa litšupiso, re fetotse algorithm ho lumella khetho ea eona ea litšupiso tse nepahetseng ho latela maemo a liteko.
Taolo ya ka hare
Tatelano ya taolo e matlafatswang ka karabelo e tshwanang le ya tatelano ya sepheo mme e fuputswe ka phuputso e fapaneng (ke hore, ho etsa duplex PCR).Litaolo tsa ka hare hangata li sebelisoa ho thibela li-amplification tse hlōlehileng, joalo ka ha tatelano ea sepheo e sa lemohuoe.
Mohlala oa Calibration
Mohlala oa litšupiso (ka mohlala, RNA e hloekisitsoeng ho tsoa moleng oa sele kapa thishu) e sebelisoang ka palo e lekanyelitsoeng ho bapisa lisampole tse ling kaofela ho fumana boemo bo amanang ba mofuta oa lefutso.Mohlala oa ho lekanya e ka ba sampole efe kapa efe, empa hangata ke taolo (mohlala, sampole e sa sebetsoang kapa sampole ho tloha nakong ea lefela la teko).
Litaolo tse ntle
sebelisa karabelo ea taolo lelipalo tse tsebahalang tsa template.Litaolo tse ntle li atisa ho sebelisoa ho lekola hore na sete ea primer kapa primer-probe set e sebetsa hantle le hore karabelo e hlophisitsoe hantle.
No Template Control (NTC)
Maikutlo a taolo a nang le likarolo tsohle tse hlokahalang tsa karabelo ea amplification ntle le thempleite, eo hangata e nkeloang sebaka ke metsi.Tšebeliso ea NTC e ka fumana tšilafalo e bakoang ke tšilafalo ea reagent kapa DNA e tsoang linaheng tse ling, kahoo e netefatsa bonnete le botšepehi ba data ea ho lemoha.Ho holisa taolo ea NTC ho bontša tšilafalo.
Ha ho taolo ea RT (NRT)
Ts'ebetso ea ho ntšoa ha RNA e kanna ea ba le DNA e setseng ea genomic, e kotsi haholo mme e le sesosa se amang boleng ba data le sera sa tlhaho sa qPCR, ka hona, ha ho etsoa liteko, e tlameha ho etselitsoe ho holisa phumano ea RNA feela.Ho na le mekhoa e 'meli, e' ngoe ke ho theha li-primers ho pholletsa le li-intron, e 'ngoe ke ho tlosa DNA ka ho feletseng, e leng eona e molemo, e tla tšohloa hamorao.Taolo ea NTR ke seipone sa boselamose ho bona tšilafalo ea DNA.Haeba ho na le amplification, ho bolela hore ho na le tšilafalo.
Litekanyetso
Maemo ke lisampole tsa palo e tsebahalang ea mahloriso kapa nomoro ea kopi e sebelisetsoang ho etsa mokokotlo o tloaelehileng.E le ho netefatsa botsitso ba maemo, sekhechana sa liphatsa tsa lefutso hangata se etsoa ka har'a plasmid mme se sebelisoa e le se tloaelehileng.
Mokokotlo o tloaelehileng
hangata e hlapolloa bonyane ka li-gradients tsa mahloriso tse 5 ka sehlahisoa se tloaelehileng ho ea ka karolelano e habeli, 'me lintlha tse 5 li huloa ka likhokahanyo tsa boleng ba CT le nomoro ea kopi,' me lintlha li hokahane ho etsa mola ho hlahisa lekhalo le tloaelehileng.Bakeng sa curve e 'ngoe le e' ngoe e tloaelehileng, bonnete ba eona bo hloka ho hlahlojoa.Boleng ba moepa bo oela pakeng tsa -3.3 le -3.8, 'me mahloriso ka' ngoe a etsoa ka makhetlo a mararo.Lintlha tse fapaneng haholo le lintlha tse ling li lokela ho lahloa.Boleng ba CT ba sampuli e lokelang ho lekoa bo tlisoa ka har'a sekhahla se tloaelehileng, 'me boemo ba polelo ea sampuli e lokelang ho lekoa bo ka baloa.
Boleng ba CT ba sampuli e lokelang ho lekoa bo tlisoa ka har'a sekhahla se tloaelehileng, 'me palo ea pele ea kopi ea sampuli e lokelang ho lekoa e ka baloa.
Bokhoni le Moepa
Moepa oa curve o tloaelehileng o emela bokhoni ba PCR ea nako ea nnete.
·Moepa oa -3.322 o bonts'a hore matla a ntlafatso a PCR a sebetsa hantle ka 1, kapa 100%, mme palo ea sehlahisoa sa PCR e imena habeli potolohong ka 'ngoe.
·Moepa o ka tlase ho -3.322 (mohlala, -3.8) o supa bokhoni ba PCR
·Moepa o moholo ho feta -3.322 (mohlala, -3.0) o bonts'a hore ts'ebetso ea PCR e bonahala e le kholo ho feta 100%, e leng ntho e makatsang, ke joang potoloho e le 'ngoe ea PCR e ka hlahisang ho feta habeli sehlahisoa se matlafalitsoeng?Boemo bona bo etsahala karolong e sa tsitsang ea karabelo ea PCR, ke hore, ho na le palo e kholo ea matlafatso e sa khetheheng.
ho qhibidiha
Kamora hore ntlafatso ea qPCR e phetheloe, sehlahisoa sa PCR sea futhumatsoa.Ha mocheso o ntse o phahama, sehlahisoa sa amplification se nang le likarolo tse peli sea qhibiliha butle-butle, se fella ka ho fokotseha ha matla a fluorescence.Ha mocheso o itseng (Tm) o fihlile, palo e kholo ea lihlahisoa e tla qhibiliha.Fluorescence e theoha haholo.Lihlahisoa tse fapaneng tsa PCR li na le litekanyetso tse fapaneng tsa Tm le mocheso o fapaneng oa ho qhibiliha, e le hore ho ka tsebahatsoa hore na PCR ke efe.
Mokokotlo o qhibilihang (mokokotlo o tsoang)
The melting curve e entsoe ho theha 'mapa oa tlhoro, o ka bonts'ang boemo ba likhechana tsa sehlahisoa sa PCR ka mokhoa o hlakileng.Kaha mocheso o qhibilihang ke boleng ba Tm ba sekhechana sa DNA, likarolo tse ling tse amang boleng ba Tm ea sekhechana sa DNA li ka ahloloa, joalo ka boholo ba sekhechana, litaba tsa GC, joalo-joalo.bolelele ba sehlahisoa se matlafalitsoeng bo maemong a 80-300bp, kahoo mocheso o qhibilihang o lokela ho ba pakeng tsa 80 ° C le 90 ° C.
Tlhaloso ea lekhalo la ho qhibiliha: Haeba tlhōrō e kholo feela e hlaha pakeng tsa 80 ° C-90 ° C, ho bolela hore fluorescent quantitative PCR e phethahetse;haeba tlhōrō e kholo e hlaha pakeng tsa 80 ° C-90 ° C le litlhōrō tse sa tšoaneng li hlaha ka tlase ho 80 ° C, "primer dimer" e nkoa e le ea bohlokoa.U ka leka ho eketsa mocheso oa annealing ho e rarolla;haeba tlhōrō e kholo e hlaha pakeng tsa 80 ° C-90 ° C, 'me tlhōrō e sa tšoaneng e hlaha hape ha mocheso o phahama, ha e le hantle ho nkoa hore ho na le tšilafalo ea DNA,' me DNA e lokela ho tlosoa sethaleng sa pele sa teko.
Ehlile, ho ntse ho na le maemo a sa tloaelehang, a tla aroloa ka bonngoe ka tlase.
3. Tsebo e tsoetseng pele
Ho etsa qPCR, ke tlameha ho re MIQE,Bonyane Informationbakeng sa Phatlalatso eaBongataPCR ea Nako ea 'NeteLiteko - boitsebiso bo fokolang ba ho hatisa lingoliloeng tse mabapi le PCR ea 'nete ea nakoliteko .E le ho nolofatsa kutloisiso ea motho e mong le e mong, re tla nolofatsa litaba tsa bohlokoa.
U ka batla mongolo oa mantlha oa MIQE Marang-rang, 'me ntho ea bohlokoa ka ho fetisisa ke hore e hlalosalethathamo la lintlha tse lokelang ho fanoa ha ho phatlalatsoa sengoloa .
Bahlahlobi ba ka ahlola boleng ba teko ka ho bala lintlha tsena;babali ba kamoso le bona ba ka sebelisa sena ho pheta kapa ho ntlafatsa teko.
Ke habohlokoa ho hlokomela hore lethathamong lena, bohlokoa ba lenane ka leng bo tšoailoe ka E kapa D ka ho latellana.E bolelang?E: lintlha tsa bohlokoa (li tlameha ho romelloa);D: tlhahisoleseding e lakatsehang (fana ka hohle kamoo ho ka khonehang).
MIQE (1)—Moqapi oa Teko
Li-scumbags tse ngata tse qetileng ho itšireletsa ka mor'a ho qeta lithuto tsa bona tsa mangolo li ke ke tsa tseba ho qapa teko ka bobona, ho bula libuka tsa bona, le ho etsa seo tichere e ba laelang ho se etsa.Ka lebaka leo, moralo oa liteko o ne o se na matla, 'me lefapha la bahlophisi la makasine le ile la bolela hore ba batla ho etsa setšoantšo sena le setšoantšo seo, kahoo ba se etsa ba tsielehile.Ke kamoo li-scumbags li etsoang kateng!
Haufi le hae, molao-motheo oa pele oa teko ke ho tsebaho tiea ha mohopolo oa liteko.Ntho ea bohlokoa ka ho fetisisa ke moralo oa liteko, 'me ntho ea bohlokoa ka ho fetisisa mabapi le moralo oa liteko ke mokhoa oa ho beha sampole e shebiloeng, sampole ea litšupiso (taolo), le palo ea ho pheta-pheta, e le hore data ea liteko e ka hlalosoa, e bapisoa le ho kholisa.
Mohlala oa sepheoe bua ka sampole e hlokang hore re bone jini eo re e batlang ka mor'a phekolo e itseng.Mohlala oa litšupisoke mohlala ntle le phekolo leha e le efe, eo hangata e bitsoang mofuta o hlaha ho baeloji.
Likopi tsa litekoli bohlokoa haholo.Ka kakaretso, palo ea likopi tse susumetsang e tlameha ho feta tse tharo.Hoa hlokahala ho khetholla hore na phetiso ea baeloji ke eng le hore na katiso ea tekheniki ke efe.
Li-Replicates tsa Likokoana-hloko: Teko e tšoanang ea netefatso e entsoeng ka lisebelisoa tse fapaneng (nako, limela, lihlopha, lipoleiti tsa karabelo).
Phetolelo ea bioloji
Ha re nke mohlala oa pheko ea chefo e bolaeang likokoanyana ea pepere.Re batla ho fafatsa chefo e bolaeang likokoanyana limeleng tse tharo tsa ABC, ebe limela tse tharo tsa ABC ke likopi tse tharo tsa bioloji, 'me ke liteko tse tšoanang tsa netefatso tse entsoeng ka lisebelisoa tse fapaneng.Empa e le teko, taolo e hlile e hlokahala, kahoo re ka fafatsa le leng la makala a semela A ho theha sehlopha sa liteko sa semela A, mme re se ke ra fafatsa makala a mang a semela A ho theha sehlopha sa taolo.Etsa se tšoanang ho B le C.
Replicates Teknoloji (Technical Replicates): Ke teko e pheta-phetoang e etselitsoeng ho qoba liphoso tse bakoang ke ts'ebetso, eo ha e le hantle e leng lesoba le kopitsoang le kenyellelitsoeng boitsebisong bo tšoanang.Liphekolo le litsamaiso ka bobeli li tlameha ho ba le litlhophiso tse ikatisang (bonyane tse tharo) tsa mofuta o lebisitsoeng le mofuta oa litšupiso tsa kahare.
Pheta-pheta ea tekheniki
Nka pepere e phekotsoeng ka chefo e bolaeang likokoanyana e le mohlala hape.Bakeng sa sehlopha sa liteko sa semela sa A, re entse masoba a mararo a PCR a 1, 2, le 3 bakeng sa mofuta oa sona oa lefutso le mofuta oa litšupiso tsa ka hare ka ho latellana, e le ho nka karolelano ka mor'a ho fumanoa.Bakeng sa taolo ea semela A Lihlopha le tsona li tšoaroa ka tsela e tšoanang.Ka mokhoa o ts'oanang, etsa phekolo e tšoanang bakeng sa limela tsa B le C.Sena ke ho pheta-pheta botekgeniki.
Ke habohlokoa ho hlokomela seose kenyang lipalo-palo ke ho pheta-pheta ha lintho tsa tlhaho, 'me ho pheta-pheta botekgeniki ke ho hlahloba hore na ho na le liketsahalo tse sa reroang tšebetsong ea liteko, e le ho etsa hore liphetho tsa liteko li tšepahale, ke hore, ho qoba liphoso ka ho nka karolelano ea tsona joalokaha re atisa ho bua.
Litaolo tse Fosahetseng—NTC le NRT
NTC (No-Template Control), taolo e se nang thempleite, e sebelisoa ho netefatsa hore na thepa ea liteko e silafetse.Ka kakaretso, metsi a sebelisoa e le template.Haeba ho na le karabelo ea fluorescent, e bontša hore tšilafalo ea nucleic acid e etsahetse ka laboratoring.
Tšilafalo ena e tsoa ho: metsi a sa hloekang, li-reagents tse sa tšoaneleheng tse nang le DNA ea tlhaho, tšilafalo ea pele, tšilafalo ea lisebelisoa tsa laboratori, tšilafalo ea aerosol, joalo-joalo, li hloka ho sebelisa RNase scavengers le RNase inhibitors.Tšilafalo ea aerosol ke eona e thata ka ho fetisisa ho e fumana.Nahana feela hore laboratoring ea hao e tšoana le mosi, e nang le li-nucleic acid tse fapa-fapaneng tse leketlileng moeeng.
NRT (No-Reverse Transcriptase), taolo ntle le transcription ea reverse, ke RNA e sa fetoheng e le taolo e mpe, e leng taolo ea masala a gDNA.
Ha ho etsoa liphatsa tsa lefutso, palo ea RNA e bonoa ka ho lemoha palo ea cDNA ka mor'a hore e fetoleloe ka morao.Haeba ho na le masala a gDNA ha RNA e hloekisoa, e tla baka liphoso liphellong tsa liteko, hobane liphetho tsa sebele tse fumanoang ke gDNA le cDNA.Boemong ba kakaretso, eseng feela cDNA, gDNA e hloka ho tlosoa ka botlalo nakong ea ho ntšoa ha RNA.
MIQE (2) —boitsebiso ba mohlala
Seo ho thoeng ke sampole sa tlhaiso-leseling se bolela hore ha re phatlalatsa sengoloa mabapi le qPCR, re tlameha ho hlalosa tlhaiso-leseling ea sampole ka ho hlaka, e leng karolo ea bohlokoa ea sengoloa.Ka mokhoa o ts'oanang, ha re sebetsa lisampole, re tlameha ho laola ts'ebetso ea rona ho netefatsa bonnete ba lisampole.
Tlhaloso ea sampuli ke sephetho feela, 'me re lokela ho ela hloko haholoanyane lisebelisoa tse nkiloeng nakong ea teko eohle.
Khetho ea lisebelisoa tsa liteko
Lisampole tsa mali - khetha mali a hloekileng, eseng ho feta lihora tse 4.Mehlala ea lisele - khetha ho bokella lisele tse ncha ka nako ea kholo e matla.Lithapo tsa Liphoofolo-Khetha lisele tse ncha tse ntseng li hōla ka matla.Semela sa Semela - Khetha lisele tse ncha, tse nyenyane.
E tlameha ebe u hlokometse hore ho na le lentsoe la bohlokoa lipolelong tsena tse 'maloa: fresh .
Bakeng sa lisampole tse ka holimo, lisebelisoa tse ntle ka ho fetisisa, tse theko e tlaase, le tse tsitsitseng 'marakeng ke lisebelisoa tsa Foregene, tse ka ntšang DNA le RNA ea tsona kapele le ha bonolo.
Animal Total RNA Isolation Kit
Semela Kakaretso ea RNA Isolation Kit
Semela Kakaretso ea RNA Isolation Kit Plus
Ho boloka lisebelisoa tsa liteko
Ka kakaretso, ha re khothaletse ho boloka lisampole, haeba maemo a lumela.Leha ho le joalo, ho na le metsoalle e mengata e sa khoneng ho etsa liteko hang ka mor'a ho etsa lisampole, 'me ba bang ba bile ba hloka ho jara litanka tsa naetrojene tse metsi ho ea tšimong bakeng sa lisampole.
Bakeng sa motsoalle oa mofuta ona ea sebetsang ka thata, nka re feela ha u utloisise lisebelisoa tsa reagent.Hona joale lik'hamphani tse ngata tse sebelisoang ke reagent li hlahisa li-reagents tse ka bolokang lisampole tsa RNA mocheso oa kamore, 'me u ka khetha ho li sebelisa.Mokhoa o tloaelehileng oa polokelo ke polokelo ea naetrojene e metsi, ho sebelisa tanka e nyane ea metsi ea naetrojene eo ho leng bonolo ho e jara.Ka mor'a ho khutlisetsa sampole laboratoring, e boloke ka sehatsetsing -80 ° C.
Bakeng sa liteko tse amang RNA, molao-motheo oa mantsoe a tšeletseng o tlameha ho lateloa:mocheso o tlase, ha ho na li-enzyme,leka potlako .
Khopolo ea mocheso o tlase e bonolo ho e utloisisa;ntle le li-enzyme, RNase e hohle lefatšeng leo re phelang ho lona (ho seng joalo u ka be u bolailoe ke HIV), kahoo mokhoa oa ho qoba RNase ha u etsa liteko ke khopolo ea bohlokoa haholo;ka potlako,Ha ho na Kung Fu lefatšeng e ke keng ea robeha, ke lebelo feela le ke keng la robeha.
Ka hona, ka tsela e itseng, ha nako ea ho hula e khuts'oane, lisebelisoa li tla ba betere.Hobaneng ho etsa joaloForegene's Kit hatisa lebelo, hobane ba e tseba hantle.
PS: Banana ba bang ba etsa liteko ka hloko haholo, empa ha ba ntle joaloka slam dunk ka mor'a lilemo tse 'maloa tsa mosebetsi.Ba nahana hore Molimo ha a na toka, o tletleba ka ba bang le hore o batla bophelo.Ha e le hantle, o ne a sa e utloisise.Ha aa ka a sireletsa RNA hantle, 'me sebapali sa slam dunk se ne se le mahlahahlaha.Ha a ntse a etsa teko, o ne a nahana hore o tla qeta slam dunk ka makhetlo a mararo, hahlano le lihlopha tse peli, empa o ile a etsa teko hantle.
Hlokomela: Butle, menyetla e mengata ea tlhaselo ea RNase.U ka ikoetlisetsa ho potlaka joang?Ha ho na mokhoa, itloaetse feela ho feta.
Bakeng sa liteko tse fapaneng le lisampole tse fapaneng, ho ntse ho hlokahala ho bala lingoliloeng tse ngata le ho khetha mokhoa o nepahetseng oa ho sebetsa.Bakeng sa mokhoa oa ho bokella le ho boloka sampole, MIQE e hloka hore e ngoloe ka ho hlaka pampiring, e le hore bahlahlobisisi ba ka hlahloba ho tšepahala ha pampiri, hape ho loketse hore bacha ba maketseng ba phete teko ea hau.
Le hoja liteko tsa baeloji li le boima, ke tsa maemo a holimo.Haeba u se hlokolosi, u ka liha lefatše.Mohlala, ho etsa SARS tlokotsing ea biochemical, kapa ho etsa raese e nyalisitsoeng ho pholosa batho ba limilione tse likete tse 1.3.Setšoantšo se ka tlase ke teko ea lik'hemik'hale, u lokela ho utloisisa hore na u motlotlo hakae ka lipatlisiso tsa hau ka ho sheba ponahalo ea hae e kang ea dick.Lebala, o seke wa mo ntshofatsa.
MIQE (3) - ho ntšoa ha nucleic acid.
Ho ntšoa ha Nucleic acid ke ketsahalo e kholo, 'me liteko tsohle tsa baeloji ea limolek'hule li qala ka ho ntšoa ha nucleic acid.Pele ho tsohle, ha re kopitseng litaba tsa MIQE mabapi le ho ntšoa ha nucleic acid.
Ha u sheba foromo ena, u ke ke ua lula holim'a metsi.Sebopeho ke thuto.E le hore u be seithuti se hloahloa, u tlameha ho botsa hore na ke hobane'ng.Litaba tsa bohlokoa tsa tafole ena ke: Phehellabohloeki, botšepehi, botsitso, le palo ea ho ntšoa ha RNA .
Karolo ea pele eats'ebetso kapa sesebelisoa ke mohato oa ho ntša nucleic acid.Haeba u sebelisa "automatic nucleic acid extractor" ho ntša (e tsoetseng pele, ka kopo ikopanye le 'na bakeng sa theko), u lokela ho bontša lebitso la mohlala la sesebelisoa.
Lebitso la kit le
hore na ho sebelisitsoe lisebelisoa life bakeng sa lintlha tsa phetoho, ke li-reagents life tse khethehileng tse kentsoeng kapa hore na ho entsoe ts'ebetso efe e khethehileng e lokela ho hlalosoa ka ho hlaka e le hore ba bang ba ka pheta teko ea hau habonolo.
Batho ba bang ba eketsa li-reagents tse khethehileng ha ba ntša lisampole tse khethehileng, ba nahana hore sena ke sebetsa sa bona sa lekunutu 'me ha ba bolelle ba bang.Ha ba ntse ba e boloka e le lekunutu, ba boetse ba lahleheloa ke monyetla oa ho etsa hore sengoloa sa hau se khanye.U se ke ua ba bohlale, u tlameha ho tšepahala ho feta naha ea khale ea Zhang lipatlisisong tsa saense, haeba u batla ho ba bohlale, sehlooho sena se tla etsa hore u be sethoto.
e tlameha ho hopola palo ea sehlahisoa sa kitha o laela kit mme o ngola sengoloa.Ka kakaretso ho na le linomoro tse peli ka har'a khiti: Nomoro ea katse (nomoro ea sehlahisoa, nomoro ea sengoloa), Lota - nomoro ea lotho ea sehlahisoa ( E sebelisoa ho bontša hore na sehlahisoa se tsoa hokae).
Ho phaella moo, nomoro ea CAS e atisa ho sebelisoa ha o laela li-reagents tsa biochemical, 'me ke tla li tsebahatsa hammoho.Nomoro ea CAS ke nomoro e fanoeng ke American Chemical Society ho moriana o mong le o mong o mocha oa lik'hemik'hale.Ka kakaretso, lipalo tse tharo li hokahanngoa ka thaha.Nomoro ea CAS ea Rushui: 7732-18-5.Hangata lik'hemik'hale li na le li-aliases tse ngata, empa nomoro ea CAS e ikhethile.Ha o laela meriana, o ka hlahloba nomoro ea eona ea CAS pele.
Haufi le hae, ke hobane'ng ha re lokela ho hlalosa lintho tsee ka ho hlaka?Ha e le hantle, ke ho hlahloba boleng ba RNA e nkiloeng.Tšebeliso ea lisebelisoa le lisebelisoa li tla etsa hore ho ntšoa ha RNA ho tsitsane.Tekanyo ea ho ntšoa ha lilaboratori tse tloaelehileng ha e kholo, 'me e ka fumanoa ka lisebelisoa.
Lintlha tsa kalafo ea DNase kapa RNase
Taba ea bohlokoa ea fluorescent quantitative PCR ke ho thibela tšilafalo ea DNA, 'me u se ke ua etsa liteko haeba ho na le tšoaetso.Ka hona, hoa hlokahala ho bolela mokhoa oo u o sebelisitseng ho sebetsana le DNA, e le ho bontša hore DNA ts'ebetsong ea liteko e tlositsoe ka ho feletseng le ka ho feletseng.e emeloang ke sets'oants'o sa moralo.
Setšoantšo sa RNA le DNA
Ka kakaretso, mokhoa oa ho tlosa DNA ke ho phekola RNA ka DNase ka mor'a ho ntšoa.Leha ho le joalo, ena ke mekhoa ea khale.Lisebelisoa tsa tlhahiso ea RNA ea khoebo li khonne ho tlosa DNA nakong ea ts'ebetso ea ho ntša ntle le ho eketsa DNase.Ka mohlala, letoto la lisebelisoa tse tsoang Foregene.
Hlokomela: Ho tlosa DNA nakong ea ho ntšoa ha RNA ke sabole e sehang ka nģa tse peli e kotsi haholo, e tla lelefatsa nako ea ts'ebetso ea tlhahiso ea RNA le ho eketsa kotsi ea ho senyeha ha RNA.Ha e le hantle, ke khoebo pakeng tsa lihlahisoa tsa RNA le bohloeki.
Ho phaella moo, palo ea DNase e kenyelelitsoeng ho silika-based adsorption column e nyenyane haholo, 'me DNase ea boleng bo phahameng e tlameha ho sebelisoa ho finyella phello.DNase e sa lekanyetsoang e ke ke ea cheka kapele le ka botlalo.Ena ke teko ea boemo ba botekgeniki ba morekisi.Ha e le hantle, ho na le bahoebi ba makatsang le ho feta ba ithorisang ka hore DNA e ka tlosoa ntle le DNase.Ho ka boleloa hore mang kapa mang ea ithorisang ka hore DNA e ka tlosoa ka ho feletseng ntle le DNase ke moferefere.DNA ke sebōpeho se batlang se tsitsitse se nang le meloho e ’meli, ’me e ke ke ea felisoa feela ka ho bua le ho tšeha.
Tlhahlobo ea tšilafalo
mokhoa oa ho hlahloba: ho lemoha electrophoresis, 1% agarose, 6V / cm, 15min, ho kenya 1-3 ul
Nucleic acid quantitative analysis
hangata e lekanyetsoa ho sebelisa UV spectrophotometer.E re ke phatlalatse pele moelelo oa litekanyetso tse tharo tsa OD260, OD280, le OD230.
·OD260nm: Ke bolelele ba ho monya ha tlhōrō e phahameng ka ho fetisisa ea ho monya ea nucleic acid, 'me boleng bo lekantsoeng ka ho fetisisa bo tloha ho 0.1 ho ea ho 1.0.Haeba ho se joalo, hlapolla kapa u tsepamise mohopolo oa sampole ho e tlisa sebakeng se lekaneng.
·OD280nm: Ke bolelele ba maqhubu a bophahamo bo phahameng ka ho fetisisa ba ho monya ha protheine le lintho tsa phenolic.
·OD230nm: Ke bolelele ba maqhubu a ho monya tlhōrō e phahameng ka ho fetisisa ea lik'habohaedreite.
Ka mor'a moo, ha re bue ka karolo ea letšoao ka leng.Bakeng sa A260, e ka sebelisoa ho lekanya tlhahiso ea nucleic acid.Ha OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.
Bakeng sa bohloeki, re hloka ho sheba likarohano tseo re li bonang hangata: OD260/280 le OD260/230.
DNA e hloekileng: OD260/280 e batla e lekana le 1.8.Ha e le khōlō ho feta 1,9, e bontša hore ho na le tšilafalo ea RNA, ’me ha e le ka tlaase ho 1,6, e bontša hore ho na le tšilafalo ea liprotheine le phenol.
RNA e hloekileng: 1.7
·OD260/230: Ebang ke DNA kapa RNA, boleng ba referense ke 2.5.Ha e le ka tlase ho 2.0, e bontša hore ho na le tšilafalo ea tsoekere, letsoai le lintho tse phelang.
Botšepehi ba RNA
Ho bohlokoa haholo ho lekanya botšepehi ba RNA.Ka kakaretso, hoa hlokahala ho etsa teko ea gel ea denaturation ea RNA ho bona hore na khanya e lipakeng tsa 28S le 18S RNA ke kamano e habeli.Ha sehlopha sa boraro sa 5S se hlaha, ho bolela hore RNA e se e qalile ho fokotseha, ntle le liphoofolo tse se nang mokokotlo.
Lintlha tsa tlhahlobo ea boleng ba RNA: Ho phaella litekong tse ka holimo, ho boetse ho na le liteko tse ling tse tsoetseng pele tsa lisebelisoa mabapi le botšepehi ba RNA, tse kang teko ea botšepehi ea RQI ea Experion automatic electrophoresis system, e ka bonang hore na RNA e senyehile ka mokhoa o sa bonahaleng.
Lipatlisisong tsa mahlale, fluorescent quantitative PCR ke papiso lipakeng tsa mofuta o lebeletsoeng le mofuta oa ka hare oa referense.Ka hona, ts'ebetsong ea ho boloka sampole ea RNA, ho ntšoa ha RNA, joalo-joalo, sepheo sa mantlha ke ho netefatsa bots'epehi ba RNA .
Hore na botšepehi ba RNA bo ama joang ho leka-lekana pakeng tsa gene e lebisitsoeng le gene ea ka hare ea boitsebiso e ka utloisisoa habonolo ho tloha setšoantšong se ka tlase.Ho senyeha ho tla lebisa ho se phetheheng ha liphatsa tsa lefutso, ebang ke ho se phethehe ha liphatsa tsa lefutso tsa ka hare kapa ho se phethehe ha liphatsa tsa lefutso, ho tla ba le tšusumetso e kholo ho data.
Sets'oants'o sa moralo oa gene le mofuta oa referense, ha se ea tlameha ho ba 'nete
Teko ea ho thibela (hore na boleng ba CT bo hatelloa tlas'a khatello e phahameng kapa e tlaase kapa maemo a mang)
Ha re nka setšoantšo sena e le mohlala, litekanyetso tsa Ct tsa li-curve tse hlano ke tse latelang.Kabo ea litekanyetso tsa CT pakeng tsa li-curve ha li lekane, 'me litekanyetso tsa Ct li lieha ho latela maemo a phahameng le a tlaase, e leng taba ea ho thibela PCR.
Ntlha ea bohlokoa: Ts'ebetsong ea ho ntša RNA, re hloka ho lahla maikutlo a fosahetseng le ho theha a nepahetseng.
Khopolo e fosahetseng ke ena: Ho ntšoa ha RNA ho lelekisa kotulo feela, ho nahana hore ha palo ea RNA e fumanoa e le khōlō, e molemonyana.Ha e le hantle, ha re etsa quantification, haeba palo ea liphatsa tsa lefutso e se khōlō haholo, ha re hloke RNA e ngata.Chelete ea RNA eo u e ntšang e feta e lekaneng .
Khopolo e nepahetseng ke:RNA e ntšoa e lokela ho phehella bohloeki, botšepehi le botsitso.Ho hloeka ho ka etsa bonnete ba hore mongolo o latelang oa reverse ha o thibeloe mme data e ke ke ea angoa ke DNA.Botšepehi bo netefatsa tekano ea tatelano ea sepheo le litšupiso tsa ka hare.Consistency e netefatsa ho tsitsa ha sampole.
MIQE (4) - phetolelo ea morao
Maikutlo a fosahetseng: ho lelekisa molumo o phahameng oa sampole.
Khopolo e nepahetseng: Phehella ho tsitsisa (botsitso), ho sa tsotellehe hore na RNA e jarisitsoe hakae, katleho ea reverse transcript e lula e tsitsitse, ho netefatsa hore phapang ea cDNA e ka bonahatsa liphapang tsa mRNA e le kannete.
Re hlalosa ts'ebetso ena ka setšoantšo sa moralo:
Sets'oants'o sa moralo oa katleho ea ho fetolela ka morao, se ke oa ba 'nete
Pele ho tsohle, re hloka ho utloisisa phapang lipakeng tsa ts'ebetso ea ho fetolela ka morao le ts'ebetso ea PCR.PCR e na le mekhoa e mengata ea ho futhumatsa le ea ho hloekisa, 'me sekhechana se lebeletsoeng se hola ka sekhahla;ha mongolo oa reverse o se na ts'ebetso ena, re ka inahanela hore mongolo oa reverse o hlile o le mong ho ea ho o mong Nakong ea ts'ebetso ea ho ikatisa, joalo ka likarolo tse ngata tsa RNA.
kaha ho na le li ka fumana likotoana tse ngata tsa cDNA Information, e lokela ho utloisisoa hona joale, hobane likhechana tse kholo le tse nyenyane li ngotsoe ka morao, 'me ho ke ke ha khoneha ho tsepamisa mohopolo ho sekhechana se le seng.Mme ka ha palo ya RNA e batla e le nyane, palo ya cDNA e fumanweng le yona e nyane, ho fapana le PCR, e nang le matla a ho hodisa, kahoo ha ho kgonehe ho lemoha.
Liphetho tsa cDNA electrophoresis
Taba ea bobeli, ha e le hantle, ho ngoloa ka morao ho etsoa motho a le mong ho ea ho a le mong, empa ha ho reverse transcriptase e tsoang k'hamphaning efe kapa efe e ka fihlelang phello ena.Ha e le hantle, katleho ea li-transcriptases tse ngata e lelera lipakeng tsa 30-50%.Haeba ho le joalo, re ka mpa ra ba le ts'ebetso e tsitsitseng e batlang e tsitsitse, e leng seo re batlang ho se bona setšoantšong: li-RNA tse 3 li fumana li-cDNA tse 2, li-RNA tse 6 li fumana li-cDNA tse 4, kahoo ho sa tsotellehe hore na ho na le sampuli e kae e kentsoeng , ts'ebetso ea ho fetolela ka morao e batla e tsitsitse.Ha re batle ho bona boemo boo bokhopo bo sa tsitsang bo sa tsitsang le moo ho sitisoang maikutlo a holimo.
Joale, u ka netefatsa joang hore na ts'ebetso ea ho fetolela ka morao e tsitsitse?Mokhoa ona o bonolo haholo, o hloka feela ho etsa tlhahlobo ea papiso: e 'ngoe ke ho khutlisa transcribe ho cDNA kamora ho hlapolloa ha RNA habeli,' me e 'ngoe ke ho etsa dilution habeli ka mor'a ho fetolela ho cDNA, ebe u etsa qPCR ho bona moepa o fumanoeng Na e lumellana.Joaloka seithuti se hloahloa, u lokela ho e utloisisa ka metsotsoana.Joalokaha ho bontšitsoe ka tlase:
Ho hlapolloa ha RNA le cDNA ho lekola hore na ho sebetsa hantle ha mongolo oa reverse ho tsitsitse
Reverse transcriptase le kit
PCR e phethahetseng ea fluorescent e ka ba le transcriptase le lisebelisoa tse ntle haholo joang.Reverse transcriptase e batla e arotsoe ka mefuta e 'meli ho latela mohloli, AMV kapaM-MLV, 'me ts'ebetso ea bona e tšoana le e bontšitsoeng tafoleng.
Mosebetsi oa RNase H
RNase H ke Ribonuclease H, lebitso la Sechaena ke ribonuclease H, e leng endoribonuclease e ka etsang hydrolyze RNA ka ho toba letotong la DNA-RNA lebasetere.RNase H e ke ke ea etsa hydrolyze li-phosphodiester bond ho DNA kapa RNA e nang le likhoele tse peli, ke hore, ha e khone ho cheka DNA kapa RNA e nang le likhoele tse peli kapa tse peli.Hangata e sebelisoa ha ho etsoa motsoako oa bobeli oa cDNA.
Ke ntho e makatsang.Re re reverse transcriptase e na le mosebetsi oa RNase H, eseng hore reverse transcriptase e na le RNase H, 'me ho ka 'na ha se ke ha khoneha ho arola RNase H ho tloha ho reverse transcriptase, mohlomong ka lebaka la ho kopana ha lihlopha tse itseng ho reverse transcriptase Ketsahalo ena e bakoa ke reverse transcriptase.
Ka hona, ho sa tsotelehe hore na AMV e sebetsa joang ka mokhoa o hlakileng, ts'ebetso ea eona ea RNase H e fokotsa tlhahiso ea cDNA.Ehlile, baetsi ba reagent ba lula ba ntlafatsa lihlahisoa tsa bona ho felisa ts'ebetso ea RNase H ho reverse transcriptase ka hohle kamoo ho ka khonehang ho eketsa chai ea cDNA.
Anealing mocheso
Sebopeho sa bobeli sa RNA ka mocheso o fapaneng
Sheba setšoantšo se ka holimo bakeng sa sebopeho sa bobeli sa RNA ka mocheso o fapaneng, 'me u sebelise sesebelisoa sa marang-rang sa mFold ho fumana sebopeho sa bobeli sa sekhechana se lebisitsoeng tlas'a maemo a itseng a mocheso le letsoai.Ka 55 ° C, mohaho oa bobeli oa RNA o ntse o rarahane haholo, reverse transcriptase e ke ke ea sebetsa, 'me mohaho oa bobeli o ke ke oa rarolloa ka ho feletseng ho fihlela 65 ° C, ha mocheso o motle oa AMV le M-MLV o le tlase haholo ho feta mocheso ona.
se o lokelang ho se etsa?Sebopeho sa bobeli ke ho kopanya ho tlatsanang ha template ka boeona, e lebisang tlhōlisanong e matla pakeng tsa primer le reverse transcriptase le thempleite, e leng se bakang letoto la mathata a kang E tlase le ho pheta-pheta hampe.
se o lokelang ho se etsa?Eketsa feela mocheso oa annealing ka hohle kamoo ho ka khonehang.
Baetsi ba li-reagent ba bangata ba ntlafatsa reverse transcriptase ka boenjiniere ba liphatsa tsa lefutso.Ba bang ba eketsa mocheso oa karabelo, joalo ka Jifan le Aidelai, 'me ba bang ba tlosa sehlopha se sebetsang sa enzyme ea RNase H ho ntlafatsa kamano pakeng tsa enzyme le thempleite ea RNA.Kamano e phahameng e ka sutumelletsa sebopeho sa bobeli ka tlholisano 'me ea bala ka thelelo, hape ea ntlafatsa haholo ts'ebetso ea ho fetolela ka morao.
Ntlha ea bohlokoa: Reverse transcript ke ea bohlokoa haholo ho phehella ho ts'oara ts'ebetsong ea ts'ebetso ea reverse transcript (li-enzyme ha lia lokela ho sebetsa hantle feela empa hape li tsitsitse), ho e-na le palo ea sampole e jarollotsoeng, haeba e se PCR e kholo haholo ea fluorescent quantitative, e ke ke ea khoneha ho hang.Li-cDNA tse ngata.
Bahlahisi ba fapaneng le bona ba entse boiteko bo itseng molemong oa ho ba le botsitso.Mohlala, lik'hamphani tse ngata li se li kentse mongolo oa reverse e le lisebelisoa tse tloaelehileng tse rekisoang, e leng khetho e ntle.
Mohlala, lisebelisoa tsa Foregene's RT Easy Series:
RT Easy I(Master premix bakeng sa lisebelisoa tsa pele tsa strand cDNA synthesis kit)
MIQE (5) - tlhahisoleseding ea liphatsa tsa lefutso
Setšoantšo se ka holimo sea hlalosa
1. Hore na lefutso lena le sebetsa litekong tse pheta-phetoang hangata ho ka netefatsoa ka liteko tse pheta-phetoang.
2. Gene ID, ua tseba.
3. Bolelele ba liphatsa tsa lefutso, bolelele bohle ba liphatsa tsa lefutso ha ho na bothata.Ha u rala li-primers, etsa bonnete ba hore bolelele ba amplicon bo pakeng tsa 80-200bp ho netefatsa ts'ebetso e ntle ea ho holisa.
4. Tatelano tlhahisoleseding ea papiso ea Blast, liphatsa tsa lefutso tse lebisitsoeng li hloka ho bapisoa le liphatsa tsa lefutso ho thibela ho hōlisa ho sa tloaelehang.
5. Ho ba teng ha li-pseudogenes.Pseudogene ke tatellano ea DNA e ts'oanang le gene e tloaelehileng empa e lahleheloa ke ts'ebetso ea eona e tloaelehileng.Hangata e teng lelapeng la liphatsa tsa lefutso tse ngata tsa eukaryotes.Hangata e emeloa ke ψ.Ke kopi ea DNA e sa sebetseng ka har'a genome e ts'oanang haholo le tatellano ea liphatsa tsa lefutso., ka kakaretso ha lia ngoloa, ’me ha li na moelelo o hlakileng oa ’mele.
6. Boemo ba li-primers tse amanang le li-exons le li-introns.Lilemong tsa pele, ha re ne re rarolla bothata ba tšilafalo ea DNA, hangata re ne re ela hloko maemo a li-primers, exons, le introns, 'me ka kakaretso re ne re nahana ka ho rala li-primers ho pholletsa le li-introns ho qoba ho holisa DNA.Ka kopo bona setšoantšo se ka tlase: botšo bo emela li-intron, tse fapaneng tse putsoa li emela li-exons, pinki li emela li-primers tse tloaelehileng, 'me bofubelu bo khanyang bo emela li-primer-spanning.
Sekema, ha se nnete
Sena se bonahala eka ke moralo o phethahetseng hakae, empa ha e le hantle, maemong a mangata, li-primers tsa trans-intron ha li na boselamose joalokaha ho nahanoa, 'me li tla boela li bake matlafatso a sa khetheheng.Kahoo tsela e molemohali ea ho thibela tšilafalo ea DNA ke ho tlosa DNA ka ho feletseng.
7. Polelo ya maemo.U sebelisa mohlala ona hape, sebelisa sesebelisoa sa marang-rang sa mFold ho fumana sebopeho sa bobeli sa sekhechana se shebiloeng ka mocheso o itseng le letsoai.
Sebopeho sa bobeli sa RNA ka mocheso o fapaneng
Sebopeho sa bobeli ke ho kopanya ho tlatsanang ha template ka boeona, e leng se tla lebisa tlhōlisanong e matla pakeng tsa ho kopanngoa ha pele le template, 'me menyetla ea ho tlama li-primer e fokotsehile, e leng se bakang letoto la mathata a kang E tlase le ho pheta-pheta ho fokolang.Ka ho bolela esale pele ka software, haeba ho se na bothata ba sebopeho sa bobeli, hoo ho ka ba monate.Haeba ho na le, sehlooho sa rona se latelang se tla tšohla ka ho khetheha mokhoa oa ho rarolla bothata bona.
MIQE (6)—qPCR Oligonucleotides
Bakeng sa fluorescent quantitative PCR, ntho ea pele eo u loantšanang le eona letsatsi le leng le le leng ke ho ntšoa ha RNA, 'me ntho ea bobeli e ka ba moralo oa primer.
Pele ho tsohle, re ntse re hlahloba melao mabapi le moralo oa primer ho latela lenane la tlhahlobo la MIQE.Ho bonolo hoo li-scumbags li ka tšehang, 'me re ka li qeta ka polelo e le' ngoe: fumana tatellano le boemo ba "primer probe" le mokhoa oa ho fetola.Bakeng sa mokhoa oa ho hloekisa pele, motsoako oa primer o theko e tlaase hona joale, qPCR e tšoaneloa ke LEQEPHE le ka holimo ho mekhoa ea ho hloekisa, 'me tlhahisoleseding ea sesebelisoa sa motsoako ha e bohlokoa.Batho ba bangata esale ba etsa li-primer ka lilemo tse mashome mme ha ba tsebe hore synthesizer ke ABI3900.
Mabapi le melao-motheo ea moralo oa primer, ha ua tlameha ho e tšoara ka hlooho, hobane boholo ba software ea moralo kapa lisebelisoa tsa marang-rang li ka rarolla mathata ana (ho khothaletsoa sesebelisoa sa inthanete primer3.ut.ee/), 'me 99.999% ea moralo oa pele ha o etsoe ka letsoho.
Sheba lintlha tse latelang ka mor'a hore li-primers li qapiloe:
1. Li-primers tsa moralo tse haufi le qetello ea 3: Tabeng ea ho sebelisa li-primers tsa oligo dT bakeng sa motsoako oa pele oa cDNA, ho nahanoa ka katleho ea reverse transcription le botšepehi ba RNA, li-primers tse entsoeng li lokela ho etsoa haufi le qetello ea 3 ho ntlafatsa katleho ea amplification .Sebelisa setšoantšo ho hlalosa ka tsela e latelang (ha ho na mokhoa oa ho utloisisa sena):
Hobaneng ha li-primers li lokela ho etsoa haufi le pheletso ea 3′, ha ea lokela ho ba 'nete
2. Boleng ba TM: Tm ea boleng ke 55-65 ° C (hobane mosebetsi oa exonuclease o phahame ka ho fetisisa ho 60 ° C), 'me litaba tsa GC li ho 40% -60%.
3. HO PHAHAMA: E le ho qoba ho holisoa ho sa tobang ha genome, Blast e tlameha ho sebelisoa bakeng sa netefatso ea tlatsetso.
MIQE(7)—qPCR tshebetso
1. qPCR kit
Ho latela litlhoko tsa MIQE, re tlameha ho hlalosa ka ho hlaka maemo a karabelo a felletseng sengolong, ho kenyelletsa le tlhophiso ea sistimi ea karabelo ea PCR, ho sebelisoa lisebelisoa life, moetsi ke mang, sistimi ea karabelo e kholo hakae, hore na ho sebelisoa mokhoa oa dae kapa mokhoa oa probe, litlhophiso tsa lenaneo la PCR.Bakhanni ba li-veteran ba tla fumana hore ha feela kit e khethiloe, lintlha tse ka holimo li ikemiselitsoe.
Hajoale, ho etsa le ho hlahisa lisebelisoa tsa fluorescent quantitative PCR ke theknoloji e holileng haholo.Ha feela o sa khethe baetsi ba bobe haholo, menyetla ea mathata ha e kholo, empa re ntse re batla ho arolelana le uena lintlha tse 'maloa:
Enzyme e qalang ea Taq:Karolo ea bohlokoahali ea PCR ke enzyme ea Taq e qalang.Li-enzyme tse qalang ho chesa 'marakeng hangata li arotsoe ka mefuta e' meli, e 'ngoe ke enzyme e fetotsoeng ka lik'hemik'hale e chesang (o ka inahanela e le ho kenya parafine),' me e 'ngoe ke Na ke enzyme e qalang e chesang bakeng sa phetoho ea antigen (e tlamang antigen-antibody).Phetoho ea lik'hemik'hale ke mokhoa oa pele oa li-enzyme tse qalang ho chesa.Ha mocheso o itseng o fihla, enzyme e tla lokolla mosebetsi oa eona.Enzyme e fetotsoeng ea antibody-modified hot-start e sebelisa mekhoa ea likokoana-hloko ho thibela tšebetso ea enzyme.Ha mocheso o itseng o fihla, lesole la 'mele le tla hlakoloa ebe le etsoa hore e be protheine, 'me tšebetso ea enzyme e tla kenngoa tšebetsong.
Leha ho le joalo, tšebeliso ea see ke efe?Ho joalo, ts'ebetso ea tokollo ea li-enzyme tse fetotsoeng ke li-antibody e potlakile ho feta ea li-enzyme tse fetotsoeng ka lik'hemik'hale, ka hona, mabapi le kutlo, li-enzyme tse fetotsoeng li na le monyetla o fokolang, e le hore ha e le hantle ha ho na li-enzyme tse fetotsoeng ka lik'hemik'hale ka har'a lisebelisoa 'marakeng.Haeba ho na le, joale thekenoloji ea moetsi enoa e ntse e tsitsitse mehleng ea sekete sa lilemo.
Khatiso ea magnesium ion:Magnesium ion concentration ke ea bohlokoa haholo karabelong ea PCR.Khatiso e nepahetseng ea magnesium ion e ka khothaletsa tokollo ea ts'ebetso ea enzyme ea Taq.Haeba mahloriso a le tlase haholo, mosebetsi oa enzyme o tla fokotseha haholo;haeba mahloriso a le holimo haholo, matlafatso ea enzyme-catalyzed non-specific a tla ntlafatsoa.Khokahano ea li-ion tsa magnesium e tla ama ho ts'oaroa ha li-primers, mocheso o qhibilihang oa template le lihlahisoa tsa PCR, ka hona, e ama tlhahiso ea likhechana tse holisitsoeng.Khatello ea li-ion tsa magnesium hangata e laoloa ho 25mM.Ehlile, bakeng sa kit e ntle, bongata ba li-ion tsa magnesium bo tlameha ho laoloa hantle.Bahoebi ba bang ba eketsa magnesium ion chelating agent ho reagent, e ka finyellang phello ea phetoho e ikemetseng ea mahloriso a magnesium ion.
Khatiso ea dae ea fluorescent:Dae ea fluorescent, e leng SYBR Green eo re atisang ho e sebelisa, haholo-holo e hlahisa fluorescence ka ho tlama ho groove e nyenyane ea DNA e nang le likarolo tse peli, hobane ho tlamaha ha dae ho DNA e nang le mefuta e 'meli ha hoa totobala, ke ho re Hafeela DNA e nang le likarolo tse peli e kopantsoe le eona, DNA e tla kopana le eona, DNA e tla kopana le eona. etsa sesupo sa bokamorao.
PS: Ka lebaka la thepa ea eona e se nang khanya, lihlahisoa tse 'marakeng hangata li kenngoa ka li-tubes tse sootho tsa opaque centrifuge (joalokaha ho bontšitsoe setšoantšong se ka tlase).Leha ho le joalo, sena se tla ba le bothata.Ho thata ho bona hore na mokelikeli oa monngoa ha ho etsoa sampole.Ntlheng ena, Qingke ehlile ke eona e sebelisang basebelisi haholo (joalo ka ha ho bonts'itsoe setšoantšong se ka tlase), mme tube e bonaletsang e kentsoe ka mokotleng oa tin opaque.Ebe u e kenya ka mokotleng oa thini, u nahanne ka boiketlo ba ho qoba leseli le sampuli.U tlameha ho khetha nomoro e nepahetseng ea sehlahisoa.TSE204 ke bophelo bo baballang chelete e ngata, bo etsang hore ke batle ho lema joang.
Khatello ea dae ea fluorescent le eona e bohlokoa haholo.Haeba mahloriso a le tlase haholo, lekhalo la amplification le ke ke la nyoloha ka morao mme ha lea phethahala;haeba mohopolo o phahame haholo, o tla baka tšitiso ea lerata.Kaha palo ea fluorescent quantitative PCR haholo-holo e itšetlehile ka boleng ba CT, haeba motsoako oa dae ea fluorescent o sa lokisoe hantle, ntlha e tlaase e molemo ho feta ntlha e phahameng.Ha e le hantle, motsoako o loketseng oa dae ke oona o molemo ka ho fetisisa.
ROX: Lidae tsa ROX li sebelisoa ho lokisa liphoso tsa matšoao a fluorescence hantle.Baetsi ba lisebelisoa tse ling ba hloka ho lekanyetsoa, ha ba bang ha ba hloke.Mohlala, ts'ebeliso ea sesebelisoa sa amplification sa Thermo Fisher Scientific's Real Time PCR hangata e hloka ho lekanyetsoa, ho kenyeletsoa 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, joalo-joalo. Litaelo tse akaretsang tsa kit li tla e hlalosa.
Foregene's qPCR Mix e boetse e na le dae ea ROX, e loketseng ho sebelisoa mefuteng e fapaneng.
Phekolo e fokolang ea hydrogen bond: Phekolo ea litlamo tsa haedrojene tse fokolang ke taba e batlang e le ea tekheniki.Ha ho letho le balileng libuka tsa lisebelisoa tse ngata, empa ha ho le ea mong oa bona ea buileng ka sehlooho sena.Ha e le hantle, ke ea bohlokoa haholo.Motsoako oa metheo haholo-holo o itšetlehile ka matla a maqhama a hydrogen.Li-bond tse matla tsa haedrojene ke ho holisa ho tloaelehileng, 'me litlamo tse fokolang tsa haedrojene li lebisa ho holisoe ka mokhoa o sa tobang.Haeba maqhama a haedrojene a fokolang a ke ke a felisoa hantle, amplification e seng e tobileng e ke ke ea qojoa.Ka har'a sebaka sa mongoli, ke lik'hamphani tse 'maloa feela tse hlokometseng bothata bona.Ha u reka kit, u ka bua ka hore na u nahanne ka tharollo tabeng ena bakeng sa kit eo u batlang ho e khetha.
Bolumo ba karabelo: Sistimi ea 20-50ul e sebelisoa hangata, mme meqolo e nyane e kanna ea baka liphoso.Ka kakaretso, litaelo tsa kit li tla khothaletsa tšebeliso ea lipalo tsa karabelo ea PCR.Se be bohlale 'me u sebelise livolume tse nyane ho boloka litšenyehelo.sepheo sa.Molumo o khothalletsoang ke barekisi o hlile o lekoa, 'me ho ka etsahala hore ebe ha ba khone ho rarolla bothata ba liphoso tse bakoang ke meqolo e nyenyane.
2. Moetsi le nomoro ea sehlooho ea poleiti ea tube
E mong le e mong o tseba molao-motheo oa fluorescent quantitative PCR.Pokello ea fluorescence e etsoa haholo-holo ka PCR tube caps.Ha u khetha lisebelisoa tsa PCR, ela hloko lintlha tse peli: phetiso e ntle ea leseli le e loketseng sesebelisoa.Ka kakaretso, mapolanka le li-tubes tsa lihlahisoa tse tloaelehileng li ntle, empa u lokela ho khetha ka hloko mabapi le ho ikamahanya le maemo, ho seng joalo u ke ke ua khona ho sebelisa sesebelisoa.
4. Tsebo ea boemo bo holimo
MIQE (8)—qPCR netefatso
Ena ke eona ntho e tlang pele ho qPCR!Bahale ba bangata ba oetse lehlabatheng mona.Ha e le hantle, ho ka etsahala hore ebe u lehlohonolo 'me liphatsa tsa lefutso tseo u ithutileng tsona li bonolo, kahoo u phaphametse ka lehaha la leqhoa haufi le moea.Lintlha tsa netefatso tsa qPCR li reretsoe ho leka ho ts'epahala ha data.Re thathamisa lintlha tse hlokahalang tsa netefatso ka tsela e latelang:
1.Teko e khethehileng
Ntho e ikhethang ea ho phahamisa liphatsa tsa lefutso ho lekoa ka ho hlahloba hore na setšoantšo sa electrophoresis ke sehlopha se le seng;netefatso ya tatellano;mothinya o qhibilihang ho bona hore na 'mapa o phahameng o le mong;netefatso ea tšilo ea enzyme le mekhoa e meng.
Mona, re tsepamisa maikutlo ho to hlahloba matlafatso e sa tobang ka ho sebelisa mokhoa oa ho qhibilihisa li-curve.Ka kakaretso, ha re rala li-primers, boholo ba sekhechana sa sehlahisoa bo hlokahala hore bo be boemong ba 80-200bp, e leng se etsang hore mocheso o qhibilihang oa sehlahisoa sa PCR 80-85 °C.Ka hona, haeba ho na le litlhōrō tse fapa-fapaneng, ho tlameha ho be le lihlahisoa tse ling tse sa khetheheng tsa amplification;haeba tlhōrō e hlaha ka tlase ho 80 ° C, ka kakaretso e nkoa e le primer dimer;haeba tlhōrō e hlaha ka holimo ho 85 ° C, ka kakaretso e nkoa e le tšilafalo ea DNA kapa ho hōlisa ka mokhoa o sa khetheheng oa likaroloana tse kholo.
Tlhokomeliso: Ka linako tse ling ho na le tlhōrō e le 'ngoe feela ho 80°C.Ka nako ena, mohopolo ona o tlameha ho khomareloa.Ho ka etsahala hore liphetho tsa amplification kaofela ke li-primer dimers.
Mokokotlo o tloaelehileng oa ho qhibiliha (tlhōrō e le 'ngoe e se nang amplification e sa tobang)
Mokokotlo o nang le bothata oa ho qhibiliha (ho hōlisa ka mokhoa o sa tobang oa litlhōrō tse sa nepahalang)
【Ho hlahloba taba】
Ho na le tlhoro e kholo, empa primer dimer e tebile
Ho qhibiliha ha tlhōrō e le 'ngoe setšoantšong se ka tlase ho ka thetsa mahlo a hau habonolo, ho nahana hore ke teko e phethahetseng, empa phello e fosahetse ka ho feletseng.Ka nako ena, re tlameha ho sheba mocheso oa ho qhibiliha.Thempereichara ea tlhōrō e ka tlase ho 80 ° C, e leng primer-dimer ka ho feletseng.
Ha ho sekhechana se shebiloeng, li-primer dimers tsohle
Mona, moena waka ha a kgone ho ema.Setšoantšo se ka tlase ke setšoantšo se nkiloeng ka selefouno se rometsoeng ho 'na ke scumbag.Li-reagents tseo a li sebelisitseng ke lihlahisoa tse sebelisoang hangata indastering.O ile a fetoha ho tloha ho mofuta o mong oa T-prefix ho ea ho mofuta o mong oa T-prefix.Ke nahana hore u se u e hakanyelitse.Sehlapa se ile sa hoeletsa ho 'na: "Sehlahisoa se sebelisitsoeng setšoantšong sa pele se setle haholo, 'me tlhōrō ha e na molekane.Hamorao, ka mor'a ho sebelisa reagent eo ue khothalelitseng, e tšoana le setšoantšo sa bobeli, se nang le litlhōrō tse tsoakiloeng.O ntlhobositse.“
Arola li-graph tse peli.Ha u sheba ka lekhetlo la pele, e 'ngoe e na le tlhōrō e le' ngoe, 'me e' ngoe e na le tlhōrō e habeli.Nonsense, tlhoro e le 'ngoe ehlile e lokile.Na hoo ke nnete?
E mpe ho feta Dou E, haeba ke beha litšoantšo tse peli setšoantšong se ka tlase, u tla utloisisa hang-hang.Ha e le hantle, re holofala habonolo ke mofuta ona oa setšoantšo.Ka mor'a ho hlahloba ka hloko, re fumane hore: tlhōrō ea setšoantšo sa pele ke 75 ° C, e leng primer dimer ka ho feletseng;tlhōrō ea palo ea bobeli e hlaha ka 75 ° C le 82 ° C, bonyane ho na le Sehlahisoa se hlahang.
Litšoantšo tsa maikutlo a tsoang ho baithuti
Kahoo bothata ba mantlha ha se bothata ba li-reagents, empa bothata ba moralo oa pele.Ka nako e ts'oanang, e boetse e paka hore mefuta e meng e meholo ha e na boleng ba tšepe, hape e paka seo mor'eso a se buileng pele: Hase letšoao la reagent le tšehetsang sehlooho sa hau.Ke sengoloa sa hau se phahamisitseng mofuta oa li-reagents.Ak'u nahane feela, haeba scumbag e sa fetole li-reagents, lintlha tse fosahetseng li ne li tla romeloa koranteng, 'me se neng se tla etsahala e ne e tla ba tlokotsi.
2. Ct boleng ba taolo e se nang letho
U se ke ua hlalosa, haeba taolo e se nang letho e na le bohlokoa ba Ct, na ha se tšilafalo?Leha ho le joalo, o ntse o hloka ho utloisisa hore na ke taolo efe e se nang letho e nang le boleng ba Ct.Haeba e le NTC, ho bolela hore ho na le DNA ea kantle ho naha joalo ka tšilafalo ea reagent.Haeba e le NRT, ho bolela hore RNA e ntšitsoeng e na le tšoaetso ea DNA.
3. Mokokotlo o tloaelehileng
Ho kenyeletsoa letsoapo le foromo ea lipalo, katleho ea PCR e ka baloa ka foromo.Teko e phethahetseng e hloka moepa oa curve e tloaelehileng ho atamela 3.32, le R² ho atamela 0.9999.
4. Linear dynamic range
The dynamic range of the reaction is linear.Ho ea ka template e sebelisetsoang ho hlahisa sekhahla se tloaelehileng, "dynamic range" e lokela ho kenyelletsa bonyane likhahla tsa mahloriso tse 5, 'me u ele hloko phetoho ea litekanyetso tsa Ct ho li-high concentration gradients le li-gradients tse tlaase.
5. Ho nepahala ha ho sibolloa
Liphetoho liphethong tsa qPCR, ke hore, ho se phetehe hantle, ke hore, ho se nepahale hantle, ho bakoa ke lintlha tse ngata, ho kenyelletsa mocheso, khatello ea maikutlo le ts'ebetso.Ho nepahala ha qPCR hangata ha ho laolehe ha palo ea kopi e fokotseha.Hantle-ntle ka har'a phapang ea liteko, phapang ena ea tekheniki e lokela ho fapana le mefuta-futa ea likokoana-hloko, 'me likopi tsa tlhaho li ka sebetsana ka ho toba le phapang ea lipalo ho liphetho tsa qPCR pakeng tsa lihlopha kapa liphekolo.Haholo-holo bakeng sa litlhahlobo tsa tlhahlobo, ho tlameha ho tlalehoa ho nepahala ho hoholo ha li-inter-assay (ho pheta-pheta) libakeng tsohle le ba sebetsang.
6. Bokhoni ba ho lemoha le LOD (ka multiplex qPCR)
LOD ke karolo e tlase haholo ea 95% ea lisampole tse ntle tse fumanoeng.Ka mantsoe a mang, mahloriso a LOD a ka har'a sete ea liphatsa tsa lefutso tse shebiloeng ha ea lokela ho feta 5% ea likarabelo tse hlolehileng.Ha ho etsoa tlhahlobo ea multiplex qPCR, haholo-holo bakeng sa ho lemoha ka nako e le 'ngoe ea liphetoho tsa ntlha kapa li-polymorphisms, multiplex qPCR e hloka ho fana ka bopaki ba hore ho nepahala ha likhechana tse ngata tse lebisitsoeng ha li fokotsehe ka har'a tube e le 'ngoe, ho lemoha hangata le ho lemoha tube e le' ngoe Katleho le LOD e lokela ho tšoana.Haholo-holo ha liphatsa tsa lefutso tsa sepheo se phahameng le liphatsa tsa lefutso tse fokolang haholo li ntse li eketseha ka nako e le 'ngoe, bothata bona bo tlameha ho eloa hloko.
Mathata le tharolloKa kakaretso, mathata a atisang ho kopana le qPCR debugging a shebana le lintlha tse latelang:
·matlafatso e sa khetheheng
· Khetho e thata ea ho tsepamisa mohopolo le bothata ka li-primer-dimers
·Mocheso oa mocheso o sa nepahaleng
·Sebopeho sa bobeli se ama bokhoni ba ho holisa
matlafatso e sa lebelloang
matlafatso e sa kgethehengetsahala , ka kakaretso ho nahanoa hore na moralo oa primer ha o tšoanelehe, empa haeba u sa potlakele ho fetola li-primers, u ka leka mekhoa e latelang pele (molao-motheo o boetse o khomaretsoe):
·Eketsa mocheso oa mocheso - leka ho etsa hore libonto tsa haedrojene tse fokolang li se ke tsa khona ho boloka;
·Ho khutsufatsa nako ea ho aneal le ho lelefatsa - fokotsa monyetla oa ho fokola ha hydrogen bond;
· Fokotsa khatello ea maikutlo - fokotsa monyetla oa ho tlama li-primers tse sa sebetseng le libaka tseo e seng sepheo sa tsona;
Boikemisetso bo tlase ba amplification
Boemo bo fapaneng le bo holisang bo sa khetheheng - katleho e tlase ea amplification , le mehato ea ho sebetsana le katleho e tlase ea amplification e fapane feela:
· Ho lelefatsa nako ea ho thiba le ho lelefatsa;
· Fetolela ho PCR ea mehato e meraro 'me u fokotse mocheso o kenang;
·Eketsa mahloriso a pele;
Ps: Baithuti ba bangata ba fumaneng mangolo ba hlahileng lilemong tsa bo-90 ha ba batle ho ithuta ho etsa liteko, 'me ba tšepa hore kit e ka rarolla bothata ka botlalo (haeba u batla ho ea k'hamphaning ea reagent ho ea etsa lipatlisiso le nts'etsopele ka mor'a ho fumana mangolo), ha e le hantle, baetsi ba reagent le bona ba nahana ka tsela ena, ke tšepa hore ke leoatla. H-bond absorption lintlha.Ho rarolla bothata habonolo, maoatla a ntse a tlameha ho bala kenyelletso ea k'hamphani ea reagent ho bona hore na ho na le ntlha e nkang litlamo tse fokolang tsa hydrogen.
Khetho e thata ea ho tsepamisa mohopolo le bothata ka li-primer-dimers
Mokhoa oa 1: Ka kakaretso, litaelo tsa kit bakeng sa qPCR li khothalelitse litsamaiso le likhakanyo tse khothaletsoang.
Mokhoa oa 2: Ho lokisa liphoso ka ho beha primer concentration gradient.Setšoantšo se ka tlase se utsuoa k'hamphaning ho etsa mohlala.Palo e ka tlase e bonts'a liphetho tsa palo ea fluorescence tse entsoeng ka likhahla tse tharo tsa "primer concentration" (100nM, 250nM, 500nM) le likhakanyo tse 'ne tsa mahloriso a litempele (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Boleng ba Ct ba liphetho tsa liteko bo raliloe ka tsela e latelang:
Khetho ea Mahlohonolo a Primer Kopanya ntlha e 'ngoe le e 'ngoe ea mantlha moleng ka tsela e latelang:
Khetho ea "primer concentration" e hlakile, kamano e haufi ea "primer concentration" ea 100nM le 250nM e betere, 'me kamano e haufi ea "primer concentration" ea 500nM e batla e fokola.Ho 100nM le 250nM, boleng ba Ct ba 250nM bo batla bo le nyane, ka hona, mahloriso a nepahetseng a primer ke 250nM.Ka kakaretso li-primer-dimers tse matla li ka bonoa moqomong oa ho qhibiliha.Ho thoe'ng haeba li-primers tse entsoeng li ke ke tsa qoba li-primer-dimers?
Mokhoa oa 3: Fokotsa palo ea li-primers le ho eketsa mocheso oa annealing (ha ho hlokahale ho hlalosa).
Boleng ba 'nete ba mocheso oa annealing ke 60°C.Haeba u sa tsebe hantle, u ka khetha joang mocheso o loketseng haholoanyane oa annealing?Karabo e tšoana le khetho ea "primer concentration" -.teko ea gradient.Nka setšoantšo ho tsoa k'hamphaning ea Bio-rad ho bontša bothata.Bakeng sa ho holisa sekhechana se itseng, beha li-gradients tse robeli tsa mocheso, e 'ngoe le e 'ngoe e na le makhetlo a mararo,' me sekhahla sa amplification se fumanehang ka tsela e latelang:
khetho ea mocheso oa mocheso:
·70°C, 69°C—Ha e le hantle, li-primers ha li khone ho kopanngoa, kahoo ha ho na ho hōlisa.
· 67.3 ° C - Ho na le tekanyo e nyenyane ea amplification qalong, 'me boleng ba Ct bo batla bo le boholo.
·64.5°C——Boleng ba Ct boa fokotseha.
·Ho 60.7 ° C, 58.0 ° C, 56.2 ° C, le 55.0 ° C, litekanyetso tsa Ct ha e le hantle li ne li atisa ho tsitsa, empa litekanyetso tsa ho qetela tsa fluorescence li ne li fapane.
Joang ho khetha?Molao-motheo: Molao-motheo oa pele ke boleng bo phahameng ba Ct.Bakeng sa boleng bo tšoanang ba Ct, khetha mocheso o phahameng oa annealing ho qoba ho fokotseha le ho hōlisa ka tsela e sa khetheheng.Le hoja ho na le boleng bo phahameng ba fluorescence ho 55 ° C, ho ka 'na ha e-ba le li-dimers kapa amplification e sa khetheheng ho eona.
Empa haeba u le bohlale joaloka uena, ka sebele u tla nahana: Ho bua ka mokhoa o utloahalang, haeba karabelo ea PCR e totobetse haholo, hafeela mahloriso a primer a feta tlhokahalo e fokolang, lintlha tse phahameng le tse tlaase ha lia lokela ho ba le phello, joalo ka lidae tsa fluorescent le dNTPs.Ehlile, ha feela mocheso oa mocheso o ntlafalitsoe hantle, phello ea "primer concentration" ho boleng ba Ct ka tlhaho e tla fokotsoa.
Thempereichara ea annealing e ntlafalitsoe ka nepo, 'me phello ea "primer concentration" ho CT e tla fokotsoa
Sebopeho sa bobeli se ama bokhoni ba ho holisa
Ha re nke setšoantšo ho Bio-rad ho bontša bothata.E boetse e etsa moralo oa mocheso oa mocheso ho holisa gene e nang le sebopeho sa bobeli.
Sebopeho sa bobeli sea hlaha
Ho ka bonoa hore ha mocheso oa mocheso o fokotseha, lihlahisoa li qala ho hlaha 'me boleng ba Ct bo tsoela pele, bo fihla ho boleng bo fokolang ho 60.7 ° C, ebe joale ha mocheso oa mocheso o fokotseha, boleng ba Ct bo ba bo boholo.Ka lehlakoreng le leng, ha mocheso o ntse o eketseha, mohaho oa bobeli oa buleha 'me katleho ea amplification ea eketseha.Kamora ho fihla mocheso o itseng, ho eketsa mocheso ho ke ke ha ntlafatsa katleho ea amplification.Hobane li-primers ha li khone ho kopanngoa ka mokhoa o tsitsitseng ka nako ena.Ka hona,batla mocheso o nang le boleng bo tlase ba Ct, e leng mocheso o motle ka ho fetisisa oa ho holisa template ea sebopeho sa bobeli!Ha e le hantle, maoatla a bohlale a tlameha ho tseba hore haeba ho sa hlokahale, ho molemo ho fetola li-primers le ho qoba sebaka sa bobeli sa mohaho.
5. Boemo ba kopo
MIQE—Tlhahlobo ea Lintlha
Tlhahlobo ea data e fanoa haholo ke sesebelisoa sa fluorescent quantitative PCR.Sehloohong se fetileng, ho entsoe mosebetsi o mongata oa tlhahlobo ea data, joalo ka taolo e se nang letho, e hlalositsoeng moralong oa teko.Liphatsa tsa lefutso tsa ka hare, linomoro tse pheta-phetoang, joalo-joalo li hlalositsoe., mona re hlalosa haholo ts'ebeliso ea qPCR.
qPCR e sebelisoa haholo, 'me netefatso ea liteko le tlhahlobo ea nucleic acid ke maemo a sebelisoang haholo.
quantification e felletseng
Log (concentration ea pele) e na le kamano ea mola le palo ea lipotoloho.Mokokotlo o tloaelehileng o ka huloa ho tsoa ho standard e nang le nomoro ea kopi e tsebahalang, ke hore, kamano e haufi ea karabelo ea amplification e ka fumanoa.Ho ea ka boleng ba Ct ba sampuli, mahloriso a sampuli a ka baloa.Palo ea litempele tse lokelang ho kenyelletsa.
Mokhoa o Felletseng oa Palo ea Palo
Bongata bo felletseng bo tlameha ho ipapisa le mothinya o tloaelehileng.Ho etsa curve e tloaelehileng, ho hlokahala maemo.Hangata, tekanyetso ke plasmid e fumanoang ka ho kopanya phatsa ea lefutso.Ke hobane'ng ha e le plasmid?Hobane DNA ea plasmid e chitja ke eona e tsitsitseng ka ho fetisisa.Hlakola sehlahisoa se tloaelehileng ka li-gradients tse 5 ho isa ho tse 6 ho ea ka karolelano e habeli (ho hlapolla ha makhetlo a 10), 'me u ele hloko ho tšoana ha u hlapolla.Lumella boleng ba Ct ho oela pakeng tsa 15-30.
Boitokisetso bo tloaelehileng
Ka nako e ts'oanang, sampuli e lokelang ho lekoa e boetse e lokela ho hlapolloa ka tsela e nepahetseng (hopola ntlha ea dilution), 'me boleng ba Ct le bona bo lokela ho oela pakeng tsa 15-30.Sehlahisoa se tloaelehileng + sampole e lokelang ho lekoa e behiloe mochining hammoho.Ka mor'a ho matha, ho ile ha etsoa lekhalo le tloaelehileng ka ntho e tloaelehileng, 'me lisampole tse lokelang ho lekoa li ile tsa tlisoa mokotleng o tloaelehileng ho bala mahloriso.
Kokoana-hloko ea Hepatitis B HBV quantification ke mokhoa o tloaelehileng oa quantification, o ka khonang ho bala palo ea kopi ea kokoana-hloko ka 1ml ea mali.
Palo ea nomoro ea kopi
Mohlala oa mahloriso o lokelang ho lekoa (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × dilution factor
Mohlala oa boima ba molek'hule = palo ea metheo × 324
Nomoro ea kopi ea sampole e lokelang ho lekoa (likopi / ul) = khatello ea sampole e lokelang ho lekoa / boima ba molek'hule ea sampole × 6 × 1014
Mokhoa oa ho bala nomoro ea kopi
Ka holimo ke mokhoa oa ho bala oa ho fumana palo.Bona ke bothata ba lipalo bo ka rarolloang ka mor'a ho qeta sekolong se phahameng, 'me mathata a lipalo hangata a rarolloa ke lik'homphieutha.Haeba u sa utloisise, u ka tla ho buisana.
quantification e lekanyelitsoeng
Relative quantification e sebelisoa haholo liphuputsong tsa saense.Ho na le likokoana-hloko tse kae ho 1ml ea mali, 'me ke kokoana-hloko ea DNA, ena ke ketsahalo e batlang e le ea bohlokoa: palo ea mali e ka khethoa,' me kokoana-hloko ea DNA e batla e tsitsitse.Leha ho le joalo, ho thata ho rona ho bapisa palo ea likopi tse ngotsoeng tsa mofuta o itseng lekhasing, hobane ho thata ho tseba boholo, boima le bonolo ba lekhasi, palo ea RNA e ntšitsoeng ho thata ho e tseba, 'me ho thata ho tseba hore na ho na le litšitiso tse kae, ke hore, mohato ofe kapa ofe o ka etsa hore data ea liteko e be le likokoana-hloko 'me e ke ke ea sebelisoa.
Ka hona, quantification e lekanyelitsoeng e tlameha ho hlahisa element:mofuta oa ka hare oa litšupiso .
Ka mantsoe a mang, palo e lekanyelitsoeng ha e le hantle ke papiso pakeng tsa gene e lebisitsoeng le mofuta oa ka hare oa referense.Ha ho bapisoa lesela le le leng le sele e le 'ngoe, tšusumetso ea boholo ba sampuli, palo ea RNA ea ho ntšoa, katleho ea ho fetolela ka morao, le bokhoni ba PCR bo batla bo fokola.Ka lebaka la boholo ba sampuli e nyane, liphatsa tsa lefutso tsa ka hare le liphatsa tsa lefutso li fokotsehile.Ke ka lebaka lena re 'nileng ra hatisa ho tšoana le botsitso pele.
Liphatsa tsa lefutso tsa ka hare ke ka kakaretsoliphatsa tsa lefutso tsa ntlo(liphatsa tsa lefutso tse bolokang ntlo), tse bolelang sehlopha sa liphatsa tsa lefutso tse hlahisoang ka mokhoa o tsitsitseng liseleng tsohle, 'me lihlahisoa tsa tsona lia hlokahala ho boloka mesebetsi ea motheo ea bophelo ba lisele.
O seke oa ferekanya mohopolo ona.Liphatsa tsa lefutso tsa ho boloka ntlo ke mantsoe a ts'ebetso ea baeloji, athe liphatsa tsa lefutso tsa kahare ke mantsoe a liteko tsa tekheniki.Liphatsa tsa lefutso tsa tlhokomelo ea matlo li hloka ho fetisa bopaki pele li ka khethoa e le liphatsa tsa lefutso tsa ka hare.
Mohlala, re khethile liphatsa tsa lefutso tse 'maloa setšoantšong se ka tlase ho leka maemo a bona a ho bua liseleng tse fapaneng tsa lisele, mme ra fumana hore maemo a polelo ea β-2-microglobulin a fapane haholo le a liphatsa tse ling tse tharo, ka hona li ne li ke ke tsa sebelisoa joalo ka liphatsa tsa lefutso tsa kahare.
Ka mor'a ho utloisisa mosebetsi oa tokiso ea liphatsa tsa lefutso tsa ka hare, li-algorithms tse peli li nkiloe ka lebaka la ho kenngoa ha liphatsa tsa lefutso tsa ka hare.
·habeli standard curve mokhoa
·2 – △△Ct mokhoa (CT mokhoa oa ho bapisa boleng)
Haeba u thahasella ho ithuta ka mefuta le mesebetsi ea liphatsa tsa lefutso, ka kopo tlohela lipatlisiso tsa li-algorithms 'me u sebelise liforomo ka kotloloho, kapa sebelisa mechini ka kotloloho;haeba u monna ea otlolohileng thutong ea lipalo le boenjiniere, ka kopo ikutloe u lokolohile.
mokokotjana o habeli o tloaelehileng
Lekanya mofuta o reriloeng le mofuta oa tlhokomelo ea ntlo oa sampole ea taolo le sampole e lokelang ho lekoa ka lekhalo le tloaelehileng, ebe u bala boleng bo lekanyelitsoeng ho latela foromo ea lipalo, e leng boemo ba polelo e lekanyelitsoeng.
Melemo: tlhahlobo e bonolo, ts'ebeliso e bonolo ea liteko
Bothata: Bakeng sa lefutso le leng le le leng, teko e 'ngoe le e 'ngoe ea liteko e tlameha ho etsa lekhalo le tloaelehileng
Kopo: E 'ngoe ea mekhoa e' meli e sebelisoang ka ho fetesisa le e tsebahalang haholo thutong ea taolo ea polelo ea liphatsa tsa lefutso.
Foromo e tjena:
Mehlala ke e latelang:
Bala palo e lekanyelitsoeng ho latela sephetho sa palo
2 – △△Ct mokhoa (CT mokhoa oa ho bapisa boleng)
Melemo: Ha ho hlokahale hore u etse mothinya o tloaelehileng
Mefokolo: Ho nahanoa hore bokhoni ba ho holisa bo haufi le 100%;ho kheloha ho tloaelehileng ke <5%, 'me sekhahla se tloaelehileng le katleho pakeng tsa amplification e' ngoe le e 'ngoe li nkoa li lumellana;ho ntlafatsa maemo a liteko ho thata ho feta.
Kopo: E 'ngoe ea mekhoa e' meli e sebelisoang ka ho fetesisa le e tsebahalang haholo thutong ea taolo ea polelo ea liphatsa tsa lefutso.
Ehlile, katleho ea ho holisa hangata ha e khonehe ho ba ka mokhoa o phethahetseng 1. Mokhoa oa ho lokisa: Haeba re tseba hore gene e reriloeng le mofuta oa referense li na le ts'ebetso e ts'oanang ea amplification, empa katleho ea amplification ha e lekane le 1, joale 2△△Ct e ka lokisoa joalo ka: (1+E )－△△Ct, mohlala, 9, ka mohlala, Ct, ka mohlala, e ka lokisoa. 1.95－△△Ct
Ho fihlela joale, litaba tse mabapi le fluorescent quantitative PCR li felile.
Nako ea poso: Apr-06-2023
