Real Time PCR, e tsejoang hape e le quantitative PCR kapa qPCR, ke mokhoa oa ho lekola le ho sekaseka lihlahisoa tsa PCR ka nako ea nnete.
Hobane PCR e ngata e na le melemo ea ts'ebetso e bonolo, e potlakileng le e bonolo, e nang le kutlo e phahameng, ho pheta-pheta hantle, le tekanyo e tlaase ea tšoaetso, e sebelisoa haholo litekong tsa bongaka, tlhahlobo ea katleho ea lithethefatsi, lipatlisiso tsa liphatsa tsa lefutso, lipatlisiso tsa transgenic, ho lemoha liphatsa tsa lefutso, ho lemoha likokoana-hloko, ho lemoha liphoofolo le limela., tlhahlobo ea lijo le masimo a mang.
Ka hona, ho sa tsotellehe hore na u etsa lipatlisiso tsa motheo tsa saense ea bophelo, kapa basebetsi ba lik'hamphani tsa meriana, lik'hamphani tse ruuoang liphoofolo, lik'hamphani tsa lijo, kapa esita le basebetsi ba liofisi tsa tlhahlobo ea ho tsoa le ho arola batho, mafapha a tlhokomelo ea tikoloho, lipetlele le lihlopha tse ling, u tla be u pepesehetse kapa u hloka ho tseba tsebo ea ho tseba PCR e ngata.

Molao-motheo oa Nako ea 'Nete PCR

Nako ea 'nete ea PCR ke mokhoa oo lintho tsa fluorescent li kenyelletsoang ho sistimi ea karabelo ea PCR, mme matla a lets'oao la fluorescence ts'ebetsong ea karabelo ea PCR e beoa leihlo ka nako ea nnete ke sesebelisoa sa PCR sa bongata, mme qetellong data ea liteko e hlahlojoa le ho sebetsoa.

【Mokokotlo oa ho phahamisa】ke curve e hlalosang ts'ebetso e matla ea PCR.Mokokotlo oa ho holisa oa PCR ha e le hantle ha se lekhalo le tloaelehileng la exponential, empa ke lekhalo la sigmoid.

[Mohato oa sethala sa amplification curve]Ka keketseho ea palo ea lipotoloho tsa PCR, ho se sebetse ha DNA polymerase, ho fokotseha ha dNTP le li-primers, le ho thibela karabelo ea synthesis ka karabelo ea sehlahisoa sa pyrophosphate, joalo-joalo, PCR ha e atolohe ka mokhoa o fetisisang kamehla., mme qetellong e tla kena sehlabeng.

[Sebaka sa Khōlo e Khōlō ea Mokokotlo oa Amplification]Leha karolo ea sehlaba e fapana haholo, sebakeng se itseng sa sebaka sa kholo ea kholo ea sekhahla sa amplification, ho pheta-pheta ho molemo haholo, ho bohlokoa haholo bakeng sa tlhahlobo ea palo ea PCR.

[Molemo le boleng ba Ct]Re beha boleng ba moeli oa ho lemoha ha fluorescence sebakeng se loketseng sebakeng sa kholo ea exponential ea curve ea amplification, e leng threshold value (Threshold).Phapano ea boleng ba threshold le curve ea amplification ke boleng ba Ct, ke hore, boleng ba Ct bo bolela palo ea lipotoloho (Threshold Cycle) ha tekanyo ea moeli e fihla.

Kerafo e ka tlase e bontša ka ho hlaka kamano pakeng tsa threshold line le amplification curve, threshold le Ct value.

【Joang ho lekanya?】

Ho 'nile ha pakoa ke thuto ea lipalo hore boleng ba Ct bo na le kamano e fapaneng ea mola le logarithm ea palo ea litempele tsa pele.Real Time PCR e lekola lihlahisoa tsa ntlafatso ea PCR ka nako ea 'nete ebe e li lekanya nakong ea mohato oa ho holisa.

Bakeng sa potoloho e 'ngoe le e' ngoe ea PCR, DNA e ile ea eketseha ka makhetlo a 2, 'me kapele ea fihla sehlabeng.

Ho nka hore palo ea ho qala DNA ke A₀ , ka mor'a lipotoloho tsa n, palo ea theory ea sehlahisoa sa DNA e ka hlalosoa e le:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Joale, ha palo ea pele ea DNA ea A 0 e le teng, kapele palo ea sehlahisoa se holisitsoeng se fihla boleng ba ho lemoha An, 'me palo ea lipotoloho ha e fihla ho An ke boleng ba Ct.Ka mantsoe a mang, ha palo ea pele ea DNA A 0 e ntse e eketseha, ke moo lebelo la amplification le phahamang, 'me ka tsela e tšoanang palo e hlokahalang ea lipotoloho n e nyane.

Re etsa phokotso ea maemo a tloaelehileng a mahloriso mme re e sebelisa e le template ea 'Nete ea Nako ea PCR,' me letoto la li-curve tsa amplification li tla fumanoa ka linako tse lekanang ka tatellano ea ho qala palo ea DNA ho tloha ho ho feta ho ea ho tlase.Ho ea ka kamano ea mola pakeng tsa boleng ba Ct le logarithm ea palo ea litempele tse qalang, a[standard curve] e ka etsoa .

Ka ho fetola boleng ba Ct ba sampole e nang le mahloriso a sa tsejoeng ka har'a curve e tloaelehileng, palo ea template ea pele e nang le mahloriso a sa tsejoeng e ka fumanoa, e leng molao-motheo oa palo ea Real Time PCR.

Mokhoa oa ho lemoha oa Nako ea 'Nete PCR

Real Time PCR e lemoha lihlahisoa tse holisang PCR ka ho bona matla a fluorescence tsamaisong ea karabelo.

Molao-motheo oa Mokhoa oa ho Emedding oa Fluorescent Dye】

Lidae tsa fluorescent, joalo ka TB Green ®, e ka tlama ka mokhoa o sa tobang ho DNA e nang le mefuta e 'meli ho litsamaiso tsa PCR le fluoresce ha e tlama.

Matla a fluorescence tsamaisong ea karabelo e ile ea eketseha haholo ka keketseho ea lipotoloho tsa PCR.Ka ho lemoha matla a fluorescence, palo ea DNA amplification tsamaisong ea karabelo e ka hlahlojoa ka nako ea sebele, ebe palo ea template ea ho qala ka sampuli e ka hakanngoa ka tsela e fapaneng.

【Molao-motheo oa mokhoa oa ho hlahloba fluorescent】

sesebelisoa sa fluorescentke tatellano ea nucleic acid e nang le sehlopha sa fluorescent qetellong ea 5 le sehlopha sa quenching qetellong ea 3, e ka tlamang ka ho khetheha template.Ha probe e tsitsitse, fluorescence e hlahisoang ke fluorophore e tima ke sehlopha sa quenching 'me ha e khone ho fluoresce.Ha probe e senyehile, ntho ea fluorescent e tla ikarola ebe e ntša fluorescence.

Sesebelisoa sa fluorescent se eketsoa tharollong ea karabelo ea PCR.Nakong ea ts'ebetso ea annealing, probe ea fluorescent e tla tlama sebakeng se itseng sa template.Nakong ea ts'ebetso ea katoloso, ts'ebetso ea 5′→3′ exonuclease ea enzyme ea PCR e ka senya probe ea fluorescent e nyalisitsoeng ka thempleite, 'me ntho ea fluorescent e arotsoe ho ntša fluorescence.Ka ho bona matla a fluorescence a probe tsamaisong ea karabelo, sepheo sa ho lekola boholo ba sehlahisoa sa PCR se ka fihlelleha.

【Khetho ea Mokhoa oa ho Khetholla Fluorescence】

Haeba e sebelisoa ho khetholla tatelano ka homology e phahameng le ho etsa tlhahlobo ea PCR ea multiplex joalo ka tlhahlobo ea ho thaepa ea SNP, mokhoa oa ho hlahloba ka fluorescent o ke ke oa nkeloa sebaka.
Bakeng sa liteko tse ling tsa PCR tsa Nako ea 'Nete, ho ka sebelisoa mokhoa o bonolo, o bonolo le oa theko e tlase oa fluorescent chimera.

probesStrong specificity, e khonang ho multiplex PCR

Khaello

Litlhoko tse phahameng tse khethehileng bakeng sa ho holisa;

multiplex PCR e ke ke ea etsoaHo hlokahala ho rala li-probes tse khethehileng, litšenyehelo tse phahameng;

ka linako tse ling moralo oa probe o thata

Lihlahisoa tse Amanang: