RT-qPCR e entsoe ka theknoloji e tloaelehileng ea PCR.E eketsa lik'hemik'hale tsa fluorescent (lidae tsa fluorescent kapa li-fluorescent probes) ho sistimi ea karabelo ea PCR ea setso, mme e bona ts'ebetso ea PCR annealing le katoloso ka nako ea nnete ho latela mekhoa ea bona e fapaneng ea luminescent.Liphetoho tsa mats'oao a fluorescent bohareng li sebelisoa ho bala palo ea phetoho ea sehlahisoa potolohong ka 'ngoe ea PCR.Hona joale, mekhoa e atileng haholo ke mokhoa oa ho daea oa fluorescent le mokhoa oa probe.

Mokhoa oa ho daea ka fluorescent:
Lidae tse ling tsa fluorescent, tse kang SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, joalo-joalo, ha li hlahise khanya ka botsona, empa li ntša fluorescence ka mor'a hore li tlamelle groove e nyenyane ea dsDNA.Ka hona, qalong ea karabelo ea PCR, mochine ha o khone ho lemoha letšoao la fluorescent.Ha karabelo e tsoela pele ho annealing-extension (mokhoa oa mehato e 'meli) kapa mohato oa katoloso (mokhoa oa mehato e meraro), likhoele tse peli li buloa ka nako ena, le DNA polymerase e ncha Nakong ea motsoako oa strand, limolek'hule tsa fluorescent li kopantsoe dsDNA e nyenyane groove le ho ntša fluorescence.Ha palo ea lipotoloho tsa PCR e ntse e eketseha, lidae tse ntseng li eketseha li kopana le dsDNA, 'me lets'oao la fluorescent le lona le ntse le ntlafatsoa khafetsa.Nka mohlala oa SYBR Green Ⅰ.
Mokhoa oa ho hlahloba:
Taqman probe ke mokhoa o sebelisoang haholo oa hydrolysis.Ho na le sehlopha sa fluorescent qetellong ea 5′ ea probe, hangata FAM.Probe ka boeona ke tatelano e tlatsanang le lefutso le lebisitsoeng.Ho na le sehlopha se timang fluorescent qetellong ea 3′ ea fluorophore.Ho ea ka molao-motheo oa phetiso ea matla a fluorescence resonance (Förster resonance energy transfer, FRET), ha motlalehi oa sehlopha sa fluorescent (molek'hule ea fluorescent ea mofani) le sehlopha sa quenching fluorescent (molek'hule e amohelehang ea fluorescent) ha autofluorescence e fokola.Ka hona, qalong ea karabelo ea PCR, ha probe e lokolohile 'me e tiile tsamaisong, sehlopha sa motlalehi oa fluorescent se ke ke sa ntša fluorescence.Ha o anneal, primer le probe li tlamella template.Nakong ea katoloso, polymerase e tsoela pele ho kopanya liketane tse ncha.DNA polymerase e na le ts'ebetso ea 5'-3' ea exonuclease.Ha e fihla ho probe, DNA polymerase e tla etsa hydrolyze probe ho tloha template, e arole sehlopha sa moqolotsi oa fluorescent ho sehlopha sa quencher fluorescent, ebe e lokolla lets'oao la fluorescent.Kaha ho na le kamano e le 'ngoe pakeng tsa probe le template, mokhoa oa ho hlahloba o phahametse mokhoa oa dae ho latela ho nepahala le kutloisiso ea tlhahlobo.

Setšoantšo sa 1 Molao-motheo oa qRT-PCR

Moqapi oa pele
Melao-motheo:

Li-primers li lokela ho etsoa sebakeng se bolokehileng sa letoto la li-nucleic acid 'me li be le tse ikhethang.

Ho molemo ho sebelisa tatellano ea cDNA, 'me tatellano ea mRNA e boetse e amoheleha.Haeba ho se joalo, fumana sebopeho sa sebaka sa cds sa tatellano ea DNA.
Bolelele ba sehlahisoa sa fluorescent quantitative ke 80-150bp, e telele ka ho fetisisa ke 300bp, bolelele ba primer hangata bo pakeng tsa 17-25 bases, 'me phapang pakeng tsa li-primers tse holimo le tse tlaase ha ea lokela ho ba khōlō haholo.

Likahare tsa G + C li pakeng tsa 40% le 60%, le 45-55% ke tsona tse molemo ka ho fetisisa.
Boleng ba TM bo pakeng tsa likhato tse 58-62.
Leka ho qoba li-primer dimers le li-self-dimers, (u se ke ua hlaha ho feta lipara tse 4 tsa metheo e latellanang) sebopeho sa hairpin, haeba ho ke ke ha qojoa, etsa ΔG <4.5kJ/mol * Haeba u sa khone ho etsa bonnete ba hore gDNA e tlositsoe nakong ea reverse transcription Hloekileng, ho molemo ho qapa li-primers tsa intron, C 3 ′ e ke ke ea qoba ho qojoa, TG / GC, TG, TG, TG / mol, e ke keng ea qojoa. sebopeho se tsoelang pele (2-3) li-primers le tse seng
specific The homology ea heterogeneously amplified tatellano ka ho khetheha e ka tlaase ho 70% kapa e na le 8 e tlatsanang ea homology.
Database:
Patlo ea CottonFGD ka mantsoe a bohlokoa
Moralo oa pele:
Moqapi oa mantlha oa IDT-qPCR

Leqephe la lisebelisoa tsa meralo ea Fig2 IDT inthaneteng

Pontšo ea leqephe la sephetho sa Fig3
Moralo oa li-primer tsa lncRNA:
lncRNA:mehato e tšoanang le ea mRNA.
miRNA:Molao-motheo oa mokhoa oa stem-loop: Kaha li-miRNA tsohle ke tatellano e khutšoanyane ea hoo e ka bang 23 nt, ho lemoha PCR ka ho toba ho ke ke ha etsoa, ​​kahoo sesebelisoa sa ho latellana ha stem-loop se sebelisoa.Tatelano ya stem-loop ke DNA e nang le thapo e le nngwe e ka bang 50 nt, e ka etsang sebopeho sa hairpin ka boyona.3 'Qetello e ka etsoa e le tatellano e tlatsanang le sekhechana sa karolo ea miRNA, ebe sepheo sa miRNA se ka hokahanngoa le tatellano ea stem-loop nakong ea ho ngoloa ka morao, 'me bolelele bohle bo ka fihla ho 70bp, e tsamaellanang le bolelele ba sehlahisoa se holisitsoeng se khethiloeng ke qPCR.Moralo oa mantlha oa miRNA.
Ho lemoha ka ho kgetheha ha amplification:
Sebaka sa polokelo ea marang-rang: CottonFGD e phatloha ka tatellano e tšoanang
Ho phatloha ha lehae: Sheba ho sebelisa Blast + ho etsa blast ea lehae, linux le macos li ka theha database ea lehae ka kotloloho, sistimi ea win10 le eona e ka etsoa kamora ho kenya ubuntu bash.Theha polokelong ea libaka le ho phatloha ha lehae;bula ubuntu bash ho win10.
Tlhokomeliso: K'hothone ea Upland le sea Island ke lijalo tsa tetraploid, kahoo sephetho sa ho phatloha hangata e tla ba tse peli kapa ho feta.Nakong e fetileng, ho sebelisa li-cd tsa NAU e le polokelo ea boitsebiso ho etsa ho phatloha ho ka 'na ha fumana liphatsa tsa lefutso tse peli tse nang le liphapang tse seng kae feela tsa SNP.Hangata, liphatsa tsa lefutso tse peli tsa homologous ha li khone ho aroloa ka moralo oa primer, kahoo li tšoaroa ka tsela e tšoanang.Haeba ho na le indel e hlakileng, hangata primer e entsoe ka indel, empa sena se ka lebisa ho sebopeho sa bobeli sa primer Matla a mahala a fetoha a phahameng, a lebisang ho fokotseha ha katleho ea amplification, empa sena se ke ke sa qojoa.

Ho sibolloa ha sebopeho sa primer secondary:
Mehato:bula oligo 7 → tatellano ea thempleite ea ho kenya → koala fensetere e nyenyane → boloka → fumana primer holim'a thempleite, tobetsa ctrl+D ho seta primer length → sekaseka mefuta e fapaneng ea libopeho tsa bobeli, tse kang self-dimerization body, heterodimer, hairpin, mismatch, joalo-joalo Litšoantšo tse peli tsa ho qetela ho Setšoantšo sa 4 ke liphello tsa liteko tsa li-primers.Sephetho sa primer e ka pele e ntle, ha ho na sebopeho se hlakileng sa dimer le hairpin, ha ho na metheo e tsoelang pele e tlatsanang, 'me boleng bo feletseng ba matla a mahala bo ka tlaase ho 4.5, ha mokokotlo oa morao o bontša ho tsoela pele Metheo ea 6 e tlatsana,' me matla a mahala ke 8,8;ho phaella moo, dimer e tebileng haholoanyane e hlaha qetellong ea 3, 'me dimer ea metheo ea 4 e latellanang e hlaha.Leha matla a mahala a se holimo, 3′ dimer Chl e ka ama ka ho teba ho nepahala ha amplification le bokhoni ba ho holisa.Ho feta moo, hoa hlokahala ho hlahloba li-hairpins, li-heterodimers le li-mismatches.

Fig3 oligo7 liphetho tsa ho fumana
Ho lemoha katleho ea ntlafatso:
Bokhoni ba ho holisa ba PCR bo ama liphetho tsa PCR haholo.Hape ho qRT-PCR, katleho ea ho holisa e bohlokoa haholo bakeng sa liphetho tsa bongata.Tlosa lintho tse ling, mechini le liprothokholo tse ka har'a buffer ea karabelo.Boleng ba li-primers bo boetse bo na le tšusumetso e kholo molemong oa ho holisa qRT-PCR.E le ho netefatsa bonnete ba liphetho, bobeli ba fluorescence quantification le palo e felletseng ea fluorescence li hloka ho bona bokhoni ba ho holisa li-primers.Hoa hlokomeloa hore Ts'ebetso e sebetsang ea matlafatso ea qRT-PCR e lipakeng tsa 85% le 115%.Ho na le mekhoa e 'meli:
1. Mokhoa o tloaelehileng oa curve:
a.Kopanya cDNA
b.Phokotso ea likhahla
c.qPCR
d.Linear regression equation ho bala bokhoni ba ho holisa
2. LinRegPCR
LinRegPCR ke lenaneo la tlhahlobo ea data ea nako ea 'nete ea RT-PCR, eo hape e bitsoang data ea quantitative PCR (qPCR) e thehiloeng ho SYBR Green kapa k'hemistri e tšoanang.Lenaneo le sebelisa lintlha tse lokisoang tseo e seng tsa motheo, le etsa tokiso ea motheo ho sampole e 'ngoe le e 'ngoe ka Karohano, le etsa qeto ea fensetere-ea-linearity ebe e sebelisa tlhahlobo ea linear regression ho lumellana le mola o otlolohileng ka sete ea data ea PCR.Ho tloha moepeng oa mohala ona ho baloa katleho ea PCR ea sampole ka 'ngoe.Kakaretso ea katleho ea PCR ka amplicon le boleng ba Ct sampole ka 'ngoe li sebelisoa ho bala palo ea ho qala sampole ka 'ngoe, e hlahisoang ka li-unit tsa fluorescence tse sa fetoheng.Kenyelletso le tlhahiso ea data li etsoa ka Excel spreadsheet.Mohlala feela
ho kopanngoa hoa hlokahala, ha ho na gradient
ho hlokahala mehato:(Nka mohlala oa Bole CFX96, eseng Machine e nang le ABI e hlakileng)
teko:ke teko e tloaelehileng ea qPCR.
Tlhahiso ea data ea qPCR:LinRegPCR e ka lemoha mefuta e 'meli ea lifaele tse hlahisoang: RDML kapa sephetho sa quantification Amplification.Ha e le hantle, ke boleng ba nako ea sebele ea ho lemoha palo ea potoloho le letšoao la fluorescence ka mochine, 'me ho hōlisa ho fumanoa ka ho hlahloba boleng ba phetoho ea fluorescence ea katleho ea karolo ea linear.
Khetho ea data: Ka khopolo, boleng ba RDML bo lokela ho sebelisoa.Ho hakanngoa hore bothata ba k'homphieutha ea ka ke hore software ha e khone ho lemoha RDML, kahoo ke na le boleng ba sehlahisoa sa excel e le data ea pele.E kgothaletswa ho etsa kaba screening ya data pele, tse kang ho hloleha ho eketsa disampole, joalo-joalo lintlha ka hlakolwa ka dipholo ya data (ya e le hantle, u ke ke ua hlakola bona, LinRegPCR tla hlokomoloha lintlha tsena hamorao sethaleng)

Fig5 qPCR thomello ea data

Fig6 khetho ea lisampole tsa mokhethoa

Kenya data:Bula liphetho tsa ntlafatso ea mangolo.xls, → bula LinRegPCR → faele → bala ho tsoa ho excel → khetha liparamente joalo ka ha ho bonts'itsoe ho Setšoantšo sa 7 → OK → tobetsa ho fumana lintlha tsa motheo

Fig7 mehato ea ho kenya data ea linRegPCR

Sephetho:Haeba ho se na ho pheta-pheta, ha ho na lihlopha tse hlokahalang.Haeba ho na le pheta-pheto, lihlopha li ka hlophisoa sehlopheng sa mehlala, 'me lebitso la lefutso le kenngoe ho identifier,' me joale mofuta o tšoanang o tla hlophisoa ka bohona.Qetellong, tlanya faeleng, romella ntle ho feta, 'me u shebe liphetho.Bokhoni ba ho holisa le liphetho tsa R2 tsa seliba ka seng li tla hlahisoa.Taba ea bobeli, haeba u arola ka lihlopha, ho tla bonts'a katleho e nepahetseng ea amplification.Netefatsa hore matla a ho holisa a primer ka 'ngoe e lipakeng tsa 85% le 115%.Haeba e kholo haholo kapa e nyane haholo, ho bolela hore bokhoni ba ho holisa ba primer bo fokola.

Setšoantšo sa 8 Sephetho le tlhahiso ea data

Mokhoa oa liteko:
Litlhoko tsa boleng ba RNA:
Bohloeki:1.72.0 e bontša hore ho ka ba le masala a isothiocyanate.E hloekileng nucleic acid A260 / A230 e lokela ho ba ho pota 2. Haeba ho na le ho monya ho matla ho 230 nm, ho bontša hore ho na le metsoako ea lintho tse phelang tse kang phenate ions.Ho phaella moo, e ka fumanoa ka 1.5% ea agarose gel electrophoresis.Supa lesupa, hobane ssRNA ha e na denaturation mme logarithm ea boima ba molek'hule ha e na kamano e haufi, 'me boima ba molek'hule bo ke ke ba hlalosoa ka nepo.Tsepamiso ea maikutlo: Ka khopoloesengka tlase ho 100ng/ul, haeba mahloriso a le tlase haholo, bohloeki ka kakaretso bo tlase eseng bo bolelele

Setšoantšo sa 9 RNA gel

Ho feta moo, haeba sampole e le ea bohlokoa 'me kholiso ea RNA e phahame, ho kgothaletswa ho e qotsa ka mora ho ntshiwa, le ho hlapolla RNA ho ya ho kgatello ya ho qetela ya 100-300ng/ul bakeng sa phetolelo e kgutlang.Homokgoa wa ho kgutlisetsa morao, ha mRNA e ngoloa, li-primers tsa oligo (dt) tse ka tlamang ka ho khetheha mehatleng ea polyA li sebelisoa bakeng sa mongolo o ka morao, ha lncRNA le circRNA li sebelisa li-primer tsa hexamer (Random 6 mer) bakeng sa phetolelo e khutlisetsang morao ea RNA eohle Bakeng sa miRNA, li-prime transcription tse khethehileng tsa miRNA li sebelisoa bakeng sa leck-loop.Hona joale lik'hamphani tse ngata li hlahisitse lisebelisoa tse khethehileng tsa tailing.Bakeng sa mokhoa oa stem-loop, mokhoa oa ho roala o bonolo haholoanyane, o phahame ka ho fetisisa, 'me o boloka reagent, empa Phello ea ho khetholla li-miRNA tsa lelapa le le leng ha ea lokela ho ba hantle joaloka mokhoa oa stem-loop.Setsi se seng le se seng sa transcript se na le litlhokahalo bakeng sa pokello ea li-primers tse ikhethileng tsa lefutso (stem-loops).Tšupiso ea ka hare e sebelisoang bakeng sa miRNA ke U6.Ts'ebetsong ea ho kheloha ha stem-loop, tube ea U6 e lokela ho khutlisoa ka thoko, 'me li-primer tsa U6 tse ka pele le tse ka morao li lokela ho eketsoa ka kotloloho.Ka bobeli circRNA le lncRNA li ka sebelisa li-HKG joalo ka litšupiso tsa kahare.Hoho fumana cDNA,
haeba ho se na bothata ka RNA, cDNA le eona e lokela ho ba hantle.Leha ho le joalo, haeba phetheho ea teko e phehelloa, ho molemo ho sebelisa gene ea ka hare ea boitsebiso (Reference gene, RG) e ka khethollang gDNA ho li-CD.Ka kakaretso, RG ke lefutso la ho boloka ntlo., HKG) joalokaha ho bontšitsoe ho Setšoantšo sa 10;Ka nako eo, ke ne ke etsa protheine ea polokelo ea soya, 'me ke sebelisa actin7 e nang le li-intron e le sesupo sa kahare.Boholo ba sekhechana se matlafalitsoeng sa primer ena ho gDNA e ne e le 452bp, 'me haeba cDNA e ne e sebelisoa e le template, e ne e le 142bp.Eaba liphetho tsa liteko li fumana hore Karolo ea cDNA e hlile e silafalitsoe ke gDNA, hape e paka hore ha ho na bothata ka sephetho sa reverse transcript, mme e ka sebelisoa e le template bakeng sa PCR.Ha ho na thuso ho tsamaisa agarose gel electrophoresis ka ho toba le cDNA, 'me ke sehlopha se fapaneng, se sa kholisang.

Setšoantšo sa 10 cDNA

Boikemisetso ba maemo a qPCRhangata ha ho na bothata ho latela protocol ea kit, haholo-holo mohatong oa boleng ba tm.Haeba li-primers tse ling li sa etsoa hantle nakong ea moralo oa primer, e leng se etsang hore ho be le phapang e kholo pakeng tsa boleng ba tm le theoretical 60 ° C, ho kgothaletswa hore cDNA Ka mor'a hore lisampole li kopane, tsamaisa PCR ea gradient ka li-primers, 'me u leke ho qoba ho beha mocheso ntle le lihlopha e le boleng ba TM.

Tlhahlobo ea lintlha

Mokhoa o tloaelehileng oa ho sebetsa oa Fluorescence quantitative PCR o ipapisitse le 2-ΔΔCT.Template ea ts'ebetso ea data.

Lihlahisoa tse Amanang:

Nako ea 'Nete PCR Easy^TM – Taqman

Nako ea 'Nete PCR Easy^TM – SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix bakeng sa motsoako oa pele oa cDNA)

RT Easy II(Master Premix bakeng sa motsoako oa pele oa cDNA bakeng sa qPCR)