Motheo oa moralo oa mantlha (mathata a 99% a ka rarolloa)
1. Bolelele ba Primer: Buka ea thuto e hloka 15-30bp, hangata e ka bang 20bp.Boemo ba sebele bo molemo ho ba 18-24bp ho netefatsa ho khetheha, empa nako e telele e ntle, e telele haholo e tla fokotsa ho khetheha, le ho fokotsa chai.
2. Primer amplification span: 200-500bp e loketse, 'me sekhechana se ka atolosoa ho 10kb tlas'a maemo a itseng.
3. Primer base: Litaba tsa G + C e lokela ho ba 40-60%, phello e fokolang haholo ea G + C ha e ntle, G + C e ngata haholo e bonolo ho hlaha lihlopha tse sa khetheheng.ATGC e ajoa ka ho fetisisa ka mokhoa o sa reroang, ho qoba lihlopha tse fetang 5 tsa purine kapa pyrimidine nucleotide.Multi-gc bakeng sa 5 'qetellong le tatellano e bohareng ho eketsa botsitso, qoba GC e ruileng qetellong ea 3', ha ho na GC bakeng sa metheo ea ho qetela ea 3, kapa ha ho na GC bakeng sa 3 ea metheo ea ho qetela ea 5.
4. Qoba sebopeho sa bobeli ho li-primers, 'me u qobe ho tlatsana pakeng tsa li-primers tse peli, haholo-holo ho tlatsetsoa qetellong ea 3, ho seng joalo primer dimer e tla thehoa le lihlopha tse sa tobang li tla hlahisoa.
5. Metheo e qetellong ea li-primers tsa 3, haholo-holo tsa ho qetela le tsa pele, li lokela ho kopanngoa ka thata ho qoba ho hlōleha ha PCR ka lebaka la li-terminals tse sa sebetseng.
6. Li-primers li na le kapa li ka eketsoa ka libaka tse loketseng tsa ho phunya, 'me tatellano e matlafalitsoeng ea sepheo e lokela ho ba le libaka tse nepahetseng tsa ho phunya, tse molemo haholo bakeng sa tlhahlobo ea cleavage kapa molecular cloning.
7. Lintho tse ikhethang tsa li-primers: li-primers ha lia lokela ho ba le homology e hlakileng le tatellano e meng sebakeng sa database sa tatellano ea nucleic acid.
8. Ithute ho sebelisa software: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Moqapi ona oa inthanete o sebetsa ka ho fetisisa).
Litaba tse ka holimo li ka rarolla bonyane 99% ea mathata a moralo oa pele.
Laola lintlha tsa moralo oa primer
1. Bolelele ba pele
Bolelele ba primer ka kakaretso ke 18 ~ 30 metheo.Ka kakaretso, ntlha ea bohlokoa ka ho fetisisa e khethollang mocheso oa annealing oa primer ke bolelele ba primer.Thempereichara ea annealing ea primer hangata e khethoa (Tm value -5℃), 'me ba bang ba sebelisa boleng ba Tm ka kotloloho.Liforomo tse latelang li ka sebelisoa ho lekanya mocheso oa annealing oa li-primers.
Ha bolelele ba primer bo le ka tlase ho 20bp: [4(G+C)+2(A+T)] -5℃
Ha bolelele ba primer bo feta 20bp: 62.3℃+0.41℃(%GC) -500/length-5℃
Ho phaella moo, software e ngata e ka boela ea sebelisoa ho bala mocheso oa annealing, molao-motheo oa ho bala o tla fapana, kahoo ka linako tse ling boleng bo baloang bo ka ba le lekhalo le lenyenyane.Ho ntlafatsa karabelo ea PCR, li-primers tse khutšoane ka ho fetesisa tse netefatsang mocheso o sa feteng 54 ℃ li sebelisoa bakeng sa ts'ebetso e ntle ka ho fetesisa le boits'oaro.
Ka kakaretso, boleng ba primer bo eketseha ka ntlha ea tse 'nè bakeng sa nucleotide e' ngoe le e 'ngoe e eketsehileng, e le hore bolelele bo fokolang ba lisebelisoa tse ngata e be li-nucleotide tse 18.Moeli o ka holimo oa bolelele ba primer ha o bohlokoa haholo, haholo-holo o amana le katleho ea karabelo.Ka lebaka la entropy, ha primer e le telele, e theola sekhahla seo e tlamang ho sona ho DNA e lebisitsoeng ho etsa template e tsitsitseng e nang le likarolo tse peli bakeng sa DNA polymerase ho tlama.
Ha o sebelisa software ho rala li-primers, bolelele ba li-primer bo ka khethoa ke boleng ba TM ka lehlakoreng le leng, haholo-holo bakeng sa li-primers tsa fluorescence quantitative PCR, TM = 60 ℃ kapa tse ling li lokela ho laoloa.
2.GC litaba
Ka kakaretso, litaba tsa G+C ka tatellano ea pele ke 40% ~ 60%, 'me litaba tsa GC le boleng ba Tm ba para ea li-primers li lokela ho hokahanngoa.Haeba primer e na le tloaelo e tebileng ea GC kapa AT, palo e nepahetseng ea mohatla oa A, T kapa G le C e ka eketsoa pheletsong ea 5 ea primer.
3. Anealing mocheso
Thempereichara ea annealing e lokela ho ba 5 ℃ tlase ho feta mocheso oa unchain.Haeba palo ea li-primer bases e nyane, mocheso oa anneal o ka eketsoa ka nepo, e leng se ka eketsang boleng ba PCR.Haeba palo ea li-base e le kholo, mocheso oa annealing o ka fokotsoa ka nepo.Phapang ea mocheso o kenang lipakeng tsa li-primers tsa 4℃ ~ 6 ℃ e ke ke ea ama chai ea PCR, empa ka nepo mocheso o kenang oa para ea li-primers oa tšoana, o ka fapana lipakeng tsa 55℃ ~ 75 ℃.
4. Qoba sebaka sa bobeli sa sebopeho sa template ea amplification
Ho molemo ho qoba sebaka sa bobeli sa sebopeho sa template ha u khetha sekhechana se amplified.Sebopeho sa bobeli se tsitsitseng sa sekhechana se lebisitsoeng se ka boleloa esale pele le ho hakanngoa ke software e amehang ea khomphutha, e leng thuso bakeng sa khetho ea template.Liphetho tsa liteko li bontša hore katoloso hangata ha e atlehe ha matla a mahala (△G) a sebaka se tla atolosoa a le ka tlase ho 58.6lkJ/mol.
5. Ho se lumellane le sepheo sa DNA
Ha tatellano ea DNA e matlafalitsoeng e le kholo, primer e ka tlama likarolo tse ngata tsa DNA e lebisitsoeng, e leng se etsang hore ho be le lihlopha tse ngata tse hlahang sephethong.Lekhetlong lena hoa hlokahala ho sebelisa tlhahlobo ea software ea BLAST, sebaka sa marang-rang:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Khetha Lumellanya tatellano e 'meli (bl2seq).
Ho beha tatelano ea mantlha sebakeng sa 1 le tatellano ea DNA sebakeng sa 2 e ka feto-fetoha, 'me BLAST e lekanya tlatsetso, antisense, le menyetla e meng, kahoo basebelisi ha ba hloke ho hlokomela hore na liketane ka bobeli ke liketane tsa kutlo.U ka boela ua kenya nomoro ea GI haeba u tseba palo ea GI ea tatellano ho database, kahoo ha ua tlameha ho beha karolo e kholo ea tatellano.Qetellong, tobetsa Lumellanya ho 3 ho bona hore na primer e na le libaka tse ngata tsa homologous ho DNA e lebisitsoeng.
6. Primer terminal
Qetello ea 3 ea primer ke moo katoloso e qalang, kahoo ho bohlokoa ho thibela ho se lumellane ho qala moo.Qetello ea 3 ha ea lokela ho ba ho feta 3 ka tatellano ea G kapa C, hobane sena se tla etsa hore primer e qalisoe ka phoso sebakeng sa tatellano ea ntlafatso ea G+C.Qetello ea 3 e ke ke ea theha sebopeho leha e le sefe sa bobeli, ntle le ka liketso tse khethehileng tsa PCR (AS-PCR), qetello ea 3' ea primer e ke ke ea bapisoa.Ka mohlala, haeba sebaka sa khouto se matlafatsoa, 3 'qetello ea primer ha ea lokela ho felisoa sebakeng sa boraro sa codon, hobane sebaka sa boraro sa codon se atisa ho senyeha, se tla ama ho khetheha le katleho ea ho phahamisa.Ha u sebelisa li-primers tsa annexation, sheba tafole ea tšebeliso ea codon, ela hloko khetho ea likokoana-hloko, u se ke ua sebelisa li-primers tsa annexation qetellong ea 3′, 'me u sebelise li-primers tse phahameng (1uM-3uM).
7. Sebopeho sa bobeli sa li-primers
Li-primer ka botsona ha lia lokela ho ba le tatellano e tlatselletsang, ho seng joalo li-primer ka botsona li tla phutha meaho ea moriri oa moriri, 'me sebopeho sena sa bobeli se tla ama ho tlama ha li-primers le litempele ka lebaka la tšitiso e matla.Haeba kahlolo ea maiketsetso e sebelisoa, metheo e tsoelang pele e tlatsanang ea li-primer ka boeona ha ea lokela ho ba kholo ho feta 3bp.Ha hoa lokela ho ba le ho tlatsana pakeng tsa li-primers tse peli, haholo-holo ho kopana ho tlatsanang ha 3 'qetello ho lokela ho qojoa ho thibela ho thehoa ha li-primer dimers.Ka kakaretso, ha hoa lokela ho ba le metheo e 4 e latellanang ea homology kapa tlatsetso lipakeng tsa li-primers.
8. Kenya matšoao kapa loci
Qetello ea 5 'e na le phello e fokolang ho tse khethehileng tsa amplification' me ka hona e ka fetoloa ntle le ho ama ho khetheha ha amplification.Phetoho ea "primer 5" qetellong e kenyelelitse: ho eketsa sebaka sa thibelo ea enzyme;E ngotsoe ka biotin, fluorescence, digoxin, Eu3+, joalo-joalo Hlahisa tatelano ea DNA e tlamang liprotheine;Ho hlahisa libaka tsa phetoho ea phetoho, ho kenya le ho lahleheloa ke tatellano ea phetoho ea liphatsa tsa lefutso le ho hlahisa tatellano ea li-promota, joalo-joalo. Li-bases tse eketsehileng li tla ama katleho ea ho phahamisa le ho eketsa monyetla oa ho theha li-primer dimer, empa ho tlameha ho etsoa litumello tse ling bakeng sa mohato o latelang.Tatelano e eketsehileng e seng teng ka tatellano e lebisitsoeng, joalo ka libaka tsa thibelo le tatellano ea bahlahisi, e ka eketsoa pheletsong ea 5' ea primer ntle le ho ama ho khetheha.Tatelano ena ha e kenyelelitsoe palong ea boleng ba primer Tm, empa e lokela ho lekoa bakeng sa ho tlatsana le sebopeho sa bobeli sa ka hare.
9. Li-subclone
Boholo ba nako, PCR ke ho etsa cloning ea pele feela, ebe joale re hloka ho theola sekhechana sa sepheo ho li-vector tse fapaneng, kahoo re hloka ho rala metheo e meng bakeng sa ts'ebetso e latelang mohatong oa PCR.
Tatelano e meng e etselitsoeng subcloning e akaretsoa ka tlase.
Sebaka sa thibelo ea endonuclease se kentsoe
Ho eketsa libaka tsa thibelo ea enzyme ke mokhoa o sebelisoang haholo ho fokotsa lihlahisoa tsa PCR.Ka kakaretso, sebaka sa cleavage ke metheo e tšeletseng, ho phaella ho 5 'qetellong ea sebaka sa cleavage ho hlokahala ho eketsa 2 ~ 3 metheo ea tšireletso.Leha ho le joalo, palo ea metheo ea tšireletso e hlokoang ke li-enzyme tse fapaneng e fapane.Mohlala, SalⅠ ha e hloke ts'ireletso, EcoRⅤ e hloka setsi se le 1 sa ts'ireletso, NotⅠ e hloka li-bases tse 2, 'me Hind Ⅲ e hloka lits'ireletso tse 3.
LIC e eketsa mohatla
Lebitso le felletseng la LIC ke Ligation-Independent cloning, e leng mokhoa oa cloning o qapiloeng ke Navogen ka kotloloho bakeng sa karolo ea eona ea vector ea pET.Sesebelisoa sa pET se lokisitsoeng ka mokhoa oa LIC se na le lipheletso tse khomarelang tse 12-15 tse sa tlatseheng, tse tlatsanang le lipheletso tse khomarelang tse lumellanang le sekhechana se kentsoeng.Bakeng sa merero ea ho holisa, tatellano ea primer 5′ ea sekhechana se kentsoeng e lokela ho tlatsana le vector ea LIC.3′→5′ extranect activity ea T4 DNA polymerase e ka etsa ntlha e le ’ngoe e khomarelang sekhechanang se kentsoeng ka mor’a nako e khutšoanyane.Hobane sehlahisoa se ka etsoa feela ho tsoa ho annealing e kopanetsoeng ea sekhechana se kentsoeng se lokiselitsoeng le vector, mokhoa ona o potlakile haholo ebile o sebetsa hantle, 'me o lebisitsoe ho cloning.
Directed TA clone eketsa mohatla
TA cloning ha e khone ho lebisa sekhechana ho vector, kahoo hamorao Invitrogen e ile ea hlahisa vector e neng e ka shebana le cloning, e neng e na le li-GTGGS tse 'nè tse hlahelletseng ka lehlakoreng le leng.Ka hona, moralong oa li-primers tsa PCR, tatellano e tlatsanang e lokela ho eketsoa ka mokhoa o nepahetseng, e le hore likhechana li ka "lebisoa".
Haeba u le khutšoanyane ka nako, u ka leka ho kopanya ka ho toba, ho kopanya gene le vector, e leng seo re se bitsang ET gene synthesis in musecularists.
D. Mokhoa oa ho kopanya oa In-Fusion
Ha ho ligase e hlokahalang, ha ho na karabelo e telele e hlokahalang.Hafeela tatellano e lipheletsong tse peli tsa vector ea linearized e hlahisoa Moqapi oa li-primers, joale sehlahisoa sa PCR le vector ea linearized li kenngoa ka har'a tharollo ea enzyme ea in-fusion e nang le BSA ebe e behoa mocheso oa kamore bakeng sa halofo ea hora, phetoho e ka etsoa.Mokhoa ona o loketse ka ho khetheha bakeng sa phetoho e kholo ea molumo.
10. Kopanya primer
Ka nako e 'ngoe, ho tsebahala feela ka tatellano e fokolang mabapi le moralo oa primer.Ka mohlala, haeba feela tatellano ea amino acid e tsejoa, ho kopanya ho ka etsoa.Kopo ea ho kopanya ke motsoako oa tatellano e fapaneng e emelang menyetla eohle e fapaneng e kenyelletsang amino acid e le 'ngoe.Ho eketsa ho hlaka, o ka bua ka tafole ea tšebeliso ea codon ho fokotsa ho ata ho latela khetho ea tšebeliso ea lintho tse phelang tse fapaneng.Hypoxanthine e ka kopanngoa le metheo eohle ho fokotsa mocheso o kenang oa primer.U se ke ua sebelisa lisebelisoa tse kenyelletsoeng qetellong ea 3' ea primer hobane ho kenngoa ha metheo ea ho qetela ea 3 qetellong ea 3 ho lekane ho qala PCR sebakeng se fosahetseng.Ho sebelisoa li-primer concentrations tse phahameng (1μM ho isa ho 3μM) hobane li-primers ka har'a metsoako e mengata ea li-annexation ha li tobane le thempleite eo u e batlang.
Lisebelisoa tse tala tsa PCRtaolo
1. Primer bongata
Khokahano ea primer ka 'ngoe ke 0.1 ~ 1umol kapa 10 ~ 100pmol.Ho molemo ho hlahisa sephetho se hlokahalang ka palo e tlaase ka ho fetisisa ea primer.Khatello e phahameng ea li-primer e tla baka ho se lumellane le ho holisa ka mokhoa o sa tobang, le ho eketsa monyetla oa ho etsa li-dimers lipakeng tsa li-primer.
2. Primer concentration
Khatello ea li-primers e ama tse ikhethang.Nako e nepahetseng ea "primer concentration" hangata e pakeng tsa 0.1 le 0.5μM.Likhakanyo tse phahameng tsa primer li lebisa ho holisa lihlahisoa tse sa tobang.
3. Anealing mocheso oa primer
Parameter e 'ngoe ea bohlokoa bakeng sa li-primers ke mocheso o qhibilihang (Tm).Ena ke mocheso ha 50% ea li-primers le tatellano e tlatselletsang e emeloa e le limolek'hule tsa DNA tse habeli.Tm ea hlokahala ho seta mocheso oa PCR.Haele hantle, mocheso o tlase o tlase ho lekana ho netefatsa hore li-primers li sebetsa hantle ka tatellano ea sepheo, empa li phahame ho lekana ho fokotsa tlamo e sa tobang.Thempereichara e loketseng ea annealing ho tloha ho 55 ℃ ho isa ho 70 ℃.Thempereichara ea anealing hangata e behiloe ka 5 ℃ ka tlase ho Tm ea primer.
Ho na le liforomo tse 'maloa tsa ho beha Tm, tse fapaneng haholo ho latela foromo e sebelisitsoeng le tatellano ea li-primers.Hobane liforomo tse ngata li fana ka boleng bo hakanyetsoang ba Tm, lithempereichara tsohle tsa annealing ke qalo feela.Lintlha tse khethehileng li ka ntlafatsoa ka ho hlahloba mekhoa e mengata e ntseng e phahamisa mocheso oa anneal butle-butle.Qala ka tlase ho Tm-5 ℃ e hakantsoeng, 'me butle-butle u eketse mocheso o kenang ka sekhahla sa 2℃.Mocheso o phahameng oa annealing o tla fokotsa ho thehoa ha li-primer dimers le lihlahisoa tse sa ikhethang.Bakeng sa liphetho tse ntle, li-primers tse peli li lokela ho ba le boleng ba Tm.Haeba phapang ea Tm ea li-primer pairs e feta 5 ℃, li-primers li tla bontša qalo e kholo ea bohata ka ho sebelisa mocheso o tlase oa potoloho.Haeba li-primers tse peli tsa Tm li fapane, beha mocheso ho 5℃ ka tlase ho Tm e tlase haholo.Ntle le moo, ho eketsa maemo a khethehileng, lipotoloho tse hlano li ka etsoa pele lithempereichara tsa annealing tse etselitsoeng Tm e phahameng, 'me li lateloe ke lipotoloho tse setseng lithempereichara tse etselitsoeng ho fokotsa Tm.Sena se lumella kopi e sa fellang ea template ea sebaka seo u eang ho sona ho fumanoa tlas'a maemo a thata.
4. Primer bohloeki le botsitso
Bohloeki bo tloaelehileng ba li-primers tsa tloaelo bo lekane bakeng sa lits'ebetso tse ngata tsa PCR.Ho tlosoa ha lihlopha tsa benzoyl le isobutylyl ka ho tlosa letsoai ha ho letho, kahoo ha ho kena-kenane le PCR.Lisebelisoa tse ling li hloka tlhoekiso ho tlosa tatellano efe kapa efe e sa fellang tšebetsong ea ho kopanya.Tatelano ena e fokolitsoeng e etsahala hobane katleho ea DNA synthesis chemistry ha se 100%.Ena ke ts'ebetso e chitja e sebelisang lik'hemik'hale tse pheta-phetoang ha setsi se seng le se seng se eketsoa ho etsa DNA ho tloha ho 3' ho ea ho 5'.O ka hloleha ho potoloho efe kapa efe.Li-primers tse telele, haholo-holo tse kholo ho feta li-base tse 50, li na le karolo e kholo ea tatellano e fokolang 'me e ka hloka tlhoekiso.
Sehlahisoa sa li-primers se angoa ke katleho ea k'hemistri ea maiketsetso le mokhoa oa tlhoekiso.Lik'hamphani tsa Biopharmaceutical, tse kang Cytology le Shengong, kaofela li sebelisa bonyane ba OD unit ho netefatsa tlhahiso eohle ea oligonucleoside.Li-primers tse tloaelehileng li romelloa ka mokhoa o omileng oa phofo.Ho molemo ho qhaqha li-primers ho TE e le hore mahloriso a ho qetela e be 100μM.TE e molemo ho feta metsi a deionized hobane pH ea metsi hangata e na le asiti 'me e tla baka hydrolysis ea oligonucleosides.
Ho tsitsa ha li-primers ho itšetlehile ka maemo a polokelo.Phofo e omileng le li-primers tse qhibilihisitsoeng li lokela ho bolokoa ho -20 ℃.Li-primers tse qhibilihisitsoeng ho TE maemong a maholo ho feta 10μM li ka bolokoa ka mokhoa o tsitsitseng ho -20 ℃ bakeng sa likhoeli tse 6, empa li ka bolokoa feela mocheso oa kamore (15 ℃ ho 30 ℃) nako e ka tlase ho beke e le 'ngoe.Li-primer tsa phofo tse omileng li ka bolokoa ho -20 C bonyane selemo se le seng le mocheso oa kamore (15 C ho isa ho 30 C) ho fihlela likhoeli tse peli.
5. Li-enzyme le likhakanyo tsa tsona
Hajoale, Taq DNA polymerase e sebelisitsoeng ha e le hantle ke enzyme ea boenjiniere ba liphatsa tsa lefutso e entsoeng ke libaktheria tsa coliform.Palo ea enzyme e hlokahalang ho susumetsa karabelo e tloaelehileng ea PCR e ka ba 2.5U (e bua ka kakaretso ea karabelo ea 100ul).Haeba mahloriso a phahame haholo, a ka lebisa ho matlafatso e sa khetheheng;haeba mahloriso a le tlase haholo, palo ea lihlahisoa tsa maiketsetso e tla fokotseha.
6. Boleng le mahloriso a dNTP
Boleng ba dNTP bo amana haufi-ufi le ho tsepamisa mohopolo le ho sebetsa hantle ha PCR amplification.Phofo ea dNTP e na le granular, 'me ho fapana ha eona ho lahleheloa ke ts'ebetso ea eona ea likokoana-hloko haeba e bolokiloe ka mokhoa o sa lokelang.Tharollo ea dNTP e na le acidic, 'me e lokela ho sebelisoa ka bongata bo phahameng, ka 1M NaOH kapa 1M Tris.HCL tharollo ea buffer ho lokisa PH ea eona ho 7.0 ~ 7.5, e nyenyane ea liphutheloana, polokelo e leqhoa ho -20 ℃.Ho qhibiliha ka makhetlo a mangata ho tla theola dNTP.Ho karabelo ea PCR, dNTP e lokela ho ba 50 ~ 200umol/L.Haholo-holo, tlhokomelo e lokela ho lefshoa ho mahloriso a DNTPS tse 'nè e lokela ho lekana (ho lekana ho lokisetsa mole).Haeba palo ea e 'ngoe ea tsona e fapane le tse ling (tse phahameng kapa tse tlase), ho tla ba le ho se lumellane.Ho tsepamisa mohopolo ho tlase haholo ho tla fokotsa chai ea lihlahisoa tsa PCR.dNTP e ka kopana le Mg2+ mme ea fokotsa khatello ea Mg2+ ea mahala.
7. Template (targe gene) nucleic acid
Palo le tekanyo ea tlhoekiso ea template ea nucleic acid ke e 'ngoe ea likhokahano tsa bohlokoa bakeng sa katleho kapa ho hloleha ha PCR.Mekhoa e tloaelehileng ea ho hloekisa DNA hangata e sebelisa SDS le protease K ho sila le ho lahla mehlala.Mesebetsi e ka sehloohong ea SDS ke: ho qhala lipids le liprotheine holim'a lera la sele, ka hona ho senya lesela la sele ka ho qhala liprotheine tsa membrane, le ho arola liprotheine tsa nyutlelie ka seleng, SDS e ka boela ea kopana le liprotheine le precipitate;Protease K e ka etsa hydrolyze le ho sila liprotheine, haholo-holo histones e tlanngoeng le DNA, ebe e sebelisa organic solvent phenol le chloroform ho ntša liprotheine le likarolo tse ling tsa lisele, le ho sebelisa ethanol kapa isopropyl joala ho fokotsa nucleic acid.The nucleic acid e nkiloeng e ka sebelisoa e le template bakeng sa karabelo ea PCR.Bakeng sa mehlala e akaretsang ea tlhahlobo ea kliniki, mokhoa o potlakileng le o bonolo o ka sebelisoa ho qhaqha lisele, ho ntša likokoana-hloko, ho cheka le ho tlosa liprotheine ho li-chromosome ho ea ho liphatsa tsa lefutso tsa mahala, le ho sebelisoa ka ho toba bakeng sa ho hōlisa PCR.RNA template e ntšoang hangata e sebelisa mokhoa oa guanidine isothiocyanate kapa protease K ho thibela RNase ho theola RNA.
8.Mg2 + mahloriso
Mg2+ e na le phello e kholo ho tse ikhethang le ho kotuloa ha PCR amplification.Ka kakaretso karabelo ea PCR, ha khatello ea dNTP e fapaneng e le 200umol/L, khatello e nepahetseng ea Mg2+ ke 1.5 ~ 2.0mmol/L.Khatiso ea Mg2+ e phahame haholo, mokhoa oa karabelo oa fokotseha, ho holisoa ho sa hlakang ho etsahala, khatello e tlase haholo e tla fokotsa ts'ebetso ea Taq DNA polymerase, e leng se tla fella ka ho fokotseha ha lihlahisoa tsa karabelo.
Li-ion tsa Magnesium li ama likarolo tse 'maloa tsa PCR, tse kang mosebetsi oa DNA polymerase, o amang chai;Mohlala o mong ke primer annealing, e amang ho khetheha.dNTP le template li tlamella ion ea magnesium, ho fokotsa palo ea ion ea mahala ea magnesium e hlokahalang bakeng sa ts'ebetso ea enzyme.Motsoako o nepahetseng oa magnesium ion o fapana bakeng sa li-primer pairs le li-template tse fapaneng, empa PCR e tloaelehileng e qalang ho tsepamisa mohopolo ka 200μM dNTP ke 1.5mM (hlokomela: Bakeng sa PCR ea nako ea sebele, sebelisa tharollo ea 3 ho isa ho 5mM ea magnesium ion e nang le probe ea fluorescent).Maemo a phahameng a li-ion tsa mahala tsa magnesium a eketsa chai, empa hape a eketsa matlafatso e sa tobang le ho fokotsa botšepehi.Ho fumana hore na mahloriso a nepahetseng ke afe, li-titrations tsa magnesium ion li entsoe ka li-increments tsa 0.5mM ho tloha ho 1mM ho ea ho 3mM.Ho fokotsa ho itšetleha ka magnesium ion optimization, Platinum Taq DNA polymerase e ka sebelisoa.Platinum Taq DNA polymerase e khona ho boloka ts'ebetso ho feta mefuta e mengata e mengata ea magnesium ion concentrations ho feta Taq DNA polymerase 'me ka hona e hloka ts'ebetso e fokolang.
9. Li-additives tse khothalletsang li-PC
Ntlafatso ea mocheso oa annealing, moralo oa primer, le mahloriso a ion ea magnesium e lekane bakeng sa ho holisa litempele tse ngata haholo;leha ho le joalo, litempele tse ling, ho kenyelletsa le tse nang le litaba tse phahameng tsa GC, li hloka mehato e eketsehileng.Li-additives tse amang mocheso o qhibilihang oa DNA li fana ka tsela e 'ngoe ea ho ntlafatsa boleng ba sehlahisoa le chai.Ho hlokahala denaturation e felletseng ea thempleite bakeng sa liphetho tse ntle.
Ho feta moo, sebopeho sa bobeli se thibela ho tlama ha primer le ho atolosoa ha enzyme.
Li-additives tsa PCR, tse kenyelletsang formamide, DMSO, glycerin, betaine, le Tharollo ea PCRx Enhancer Solution, li matlafatsa matlafatso.Mokhoa oa bona o ka khonehang ke ho fokotsa mocheso o qhibilihang, ka hona ho thusa ho kenngoa ha li-primers le ho thusa DNA polymerase katoloso ka sebaka sa bobeli sa sebopeho.PCRx Solution e na le melemo e meng.Ntlafatso e nyane ea magnesium ion e ea hlokahala ha e sebelisoa le Platinum Taq DNA polymerase le Platinum Pfx DNA polymerase.Kahoo, mokhoa oa Platinum o kopantsoe le tlatsetso ho eketsa ho khetheha ha o ntse o fokotsa ho itšetleha ka mokhoa oa boraro, magnesium ion optimization.Bakeng sa liphetho tse ntle, bongata ba li-additives bo lokela ho ntlafatsoa, haholo-holo DMSO, formamide, le glycerol, e thibelang Taq DNA polymerase.
10. Ho qala ho chesang
Hot start PCR ke e 'ngoe ea mekhoa ea bohlokoahali ea ho ntlafatsa boleng ba PCR ho kenyelletsa moralo o motle oa primer.Leha mocheso o nepahetseng oa bolelele ba Taq DNA polymerase e le 72 ℃, polymerase e lula e sebetsa mochesong oa kamore.Ka hona, lihlahisoa tse sa khetheheng li hlahisoa ha mocheso oa ho tšoara o le tlase ho feta mocheso oa annealing nakong ea ho lokisoa ha PCR le qalong ea mocheso oa mocheso.Ha li se li entsoe, lihlahisoa tsena tse sa tobang li atolosoa hantle.Hot-start PCR e sebetsa hantle haholo ha libaka tse sebelisetsoang moralo oa pele li lekantsoe ke sebaka sa likarolo tsa lefutso, joalo ka liphetoho tse lebisitsoeng sebakeng, polelo ea cloning, kapa kaho le ho qhekella ha liphatsa tsa lefutso tse sebelisetsoang boenjineri ba DNA.
Mokhoa o tloaelehileng oa ho fokotsa ts'ebetso ea Taq DNA polymerase ke ho lokisa tharollo ea karabelo ea PCR holim'a leqhoa le ho e beha ka har'a lisebelisoa tsa PCR tse futhumetseng.Mokhoa ona o bonolo ebile ha o theko e tlase, empa ha o phethe mosebetsi oa enzyme mme ka hona ha o felise ka botlalo ho holisa lihlahisoa tse sa ikhethang.
Thermal priming e liehisa DNA synthesis ka ho thibela karolo ea bohlokoa ho fihlela lisebelisoa tsa PCR li fihla mocheso oa denaturation.Mekhoa e mengata ea ho qalisa mocheso, ho kenyelletsa le ho lieha ho eketsa Taq DNA polymerase, e boima, haholo-holo bakeng sa lisebelisoa tse phahameng.Mekhoa e meng ea ho futhumatsa mocheso e sebelisa thebe ea boka ho koala karolo ea bohlokoa, ho kenyeletsoa li-ion tsa magnesium kapa li-enzyme, kapa ho arola likarolo tse sebetsang, joalo ka litempele le li-buffer.Nakong ea potoloho ea mocheso, likarolo tse sa tšoaneng li lokolloa 'me li kopantsoe hammoho ha boka ba boka bo qhibiliha.Joalo ka mokhoa oa ho qala ho chesa ka letsoho, mokhoa oa ho sireletsa boka o boima ebile o tloaetse ho silafala 'me ha o lokele lits'ebetso tse phahameng tsa phallo.
Platinum DNA polymerase e bonolo ebile e sebetsa hantle bakeng sa PCR e qalang e chesang.Platinum Taq DNA polymerase e na le recombinant Taq DNA polymerase e kopantsoeng le monoclonal antibody khahlanong le Taq DNA polymerase.Li-antibodies li entsoe ke PCR ho thibela ts'ebetso ea enzyme nakong ea ho ts'oaroa ha mocheso nako e telele.Taq DNA polymerase e ile ea lokolloa karabelong nakong ea 94 ℃ insulation ea mohato oa denaturation, ho khutlisetsa ts'ebetso e felletseng ea polymerase.Ho fapana le Taq DNA polymerase e fetotsoeng ka lik'hemik'hale bakeng sa ho qala mocheso, enzyme ea Platinum ha e hloke ho kenngoa ha nako e telele ho 94 ℃ (metsotso e 10 ho isa ho e 15) ho kenya polymerase.Ka PlatinumTaq DNA polymerase, 90% ea ts'ebetso ea Taq DNA polymerase e ile ea khutlisoa kamora metsotso e 2 ho 94 ℃.
11. Nest-PCR
Mehato e latellanang ea ho holisa ka ho sebelisa li-primers tse kentsoeng li ka ntlafatsa ho nepahala le kutloisiso.Potoloho ea pele ke katoloso e tloaelehileng ea lipotoloho tse 15 ho isa ho tse 20.Karolo e nyane ea sehlahisoa sa pele sa amplification e ile ea hlapolloa makhetlo a 100 ho isa ho a 1000 mme ea eketsoa mokhahlelong oa bobeli oa amplification bakeng sa li-cycle tse 15 ho isa ho tse 20.Ntle le moo, sehlahisoa sa pele se matlafalitsoeng se ka lekanngoa ka tlhoekiso ea li-gel.Sehlaha sa sehlaha se sebelisoa mokhahlelong oa bobeli oa ho holisa, o ka tlamang tatellano ea sepheo ka har'a primer ea pele.Ts'ebeliso ea PCR e lutseng e fokotsa monyetla oa ho holisa libaka tse ngata tseo ho shebiloeng ho tsona hobane ho na le tatellano e fokolang e tlatselletsang ho lihlopha tse peli tsa li-primers.Palo e ts'oanang ea lipotoloho (30 ho isa ho 40) e nang le li-primers tse tšoanang e ile ea holisa libaka tseo e seng tsa 'nete.Nested PCR e eketsa kutlo ea tatellano e lekanyelitsoeng (mohlala, li-mrnas tse sa tloaelehang) hape e ntlafatsa maemo a thata a PCRS (mohlala 5′ RACE).
12. Ho theoha PCR
Ho theola PCR ho ntlafatsa boits'oaro ka ho sebelisa maemo a thata a ho koala likheong tse 'maloa tsa pele tsa PCR.Potoloho e qala ka mocheso oa mocheso o ka bang 5℃ ho feta Tm e hakantsoeng, ebe potoloho ka 'ngoe e fokotsoa ka 1℃ ho isa ho 2℃ ho fihlela mocheso oa anneal o le ka tlase ho Tm 5℃.Ke feela template ea sebaka se nang le thuto ea homology e phahameng ka ho fetisisa e tla ntlafatsoa.Lihlahisoa tsena li ntse li tsoela pele ho hola ka lipotoloho tse latelang, li khina lihlahisoa tse sa totobalang.Ho theola PCR ho molemo bakeng sa mekhoa eo ho eona tekanyo ea homology lipakeng tsa primer le target template e sa tsejoeng, joalo ka AFLP DNA fingerprinting.
Tse amanang le PCR Kits
Mohale oa 2 × PCRTMSistimi ea Mix e na le mamello e phahameng ho li-inhibitors tsa PCR ho feta sistimi e tloaelehileng ea PCR Mix, 'me e khona ho sebetsana habonolo le ntlafatso ea PCR ea litempele tse fapaneng tse rarahaneng.Sistimi e ikhethang ea karabelo le ts'ebetso e phahameng ea Taq Hero li etsa hore karabelo ea PCR e be le bokhoni bo phahameng ba ho holisa, boits'oaro le kutlo.
Bokhoni bo phahameng ba amplification
E na le ts'ebetso ea 5'→ 3' DNA polymerase le 5'→ 3' exonuclease, ntle le ts'ebetso ea 3'→5' ea exonuclease.
Nako ea 'Nete PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Specific-optimized buffer le hot-start Taq enzyme e ka thibela ho holisoa ho sa hlakang le ho thehoa ha primer dimer.
Kutloelo-bohloko e phahameng - e khona ho bona likopi tse tlase tsa template
RT-PCR Easyᵀᴹ I(Mohato o le Mong)
Setsi sena se sebelisa mochini o ikhethileng oa Foregene reverse transcription reagent le Foregene HotStar Taq DNA Polymerase e kopantsoeng le sistimi e ikhethang ea karabelo ho ntlafatsa ka nepo matla a ho holisa le ho nepahala ha karabelo.
Nako ea poso: May-09-2023
